Name: エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（EHT）のための生物発光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶエンジニア心臓組織（EHT）移植後の免疫反応評価法。ラットを用いた生体内バイオルミネセンスイメージングにより、非侵襲的に移植片の生存と拒否反応を経時的にモニタリングできます。

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ソーニャSchrepfer、レナードコンラーディとアルネハンセンは、ドイツ学術振興（; SCHR992/3-1、SCHR992/4-1、CO 858/1-1、HA 3423/3-1 DFG）から資金提供を受けた。仕事はまた、欧州連合（EU）からトーマスEschenhagen（EUGeneHeartとAngioscaff）への補助金によって支えられている。

1。 EHTの生成と培養条件フィブリンベースのEHTの製造は、他の4に記載のように行った。簡単に言うと、移植の目的のためにフィブリンベースEHTを生成するために、マスターミックスは、新生児のROSA /ルシフェラーゼ- LEWトランスジェニックラットの心臓、ウシフィブリノーゲン及びマトリゲルから単離した細胞を含む調製した。アガロース鋳型は6ウェル培養皿に置かれたテフロンのスペーサを用いて調製した。アガロースの凝固した後、スペーサを除去し、シリコンポストラックは、鋳型に達するポストで培養皿上に置いた。 EHTを生成するには、マスターミックスは、簡単にトロンビンの計算量と混合し、金型に分注した。フィブリノーゲンの重合した後、ポストに付着EHTsシリコーンラックを静かにカスタムメイドを使用して、新しい6ウェル細胞培養皿に移し、37 ° C、7％CO 2インキュベーター内で維持さアガロースの鋳型、から削除されました細胞培養培地。 EHTは、日tenまで、細胞の培養条件下で飼育した。この期間中は、新生児ラットの心臓細胞は細長い、相互接続を開始し、シリコンの支柱の間に磁力線に沿って整列します。注入の時に、自発的な一貫性の収縮は、シリコーンの投稿を偏向、観察された。 2。 EHT注入 EHTの注入は、同種免疫応答を調べるために免疫ブラウンノルウェー（BN）ラット、または免疫不全ヌードラットのいずれかで行われた。 BNと100の重量を量るヌードラット - 150 gが、飼育標準ラット固形飼料および水を自由libidumをチャールズリバードイツ（Sandhoferウェグ7、D - 97633 Sulzfeld）から購入し、従来の条件下で飼育した。免疫不全ラットが使用されている無菌ベッド、ケージ、および滅菌水に収容されています。ドイツの倫理審査委員会は、日と動物の手順を承認した。すべての手術器具は使用前に滅菌されています。 移植手順は次のように実行されます。 ラットは、誘導チャンバーを用いて（2.5から3パーセント）イソフルランでanesthesizedされています。イソフルランに対するヒトの暴露量は、ダウンドラフトテーブルまたは非循環フードで働くことによって減らすことができます。体温は、手術中維持されます。 <ol><li>腹部領域のひげをそると麻酔中に乾燥から目を防ぐために、眼軟膏を適用する。 </li><li>その背中にネズミを置き、麻酔を維持するために、その鼻と口にフェイスマスクを置く。 </li><li> Betadineし、80％エタノールを用いて腹部を消毒する。坊主エリアの中心部からクリーンで汚れの綿棒は、髪の領域に向かって外側に移動。 </li><li>ラットは、十分に麻酔をかけていることを確認するために、後肢の足をつまんで反射神経をチェックしてください。 </li><li>動物をドレープし、腹部を開くには二つのステップで皮膚や筋肉を分離正中腹部切開を行います。ホットビーズの滅菌は、皮膚と筋肉の開口部との間で使用されています。 </li><li>暖めた生理食塩水しっとりパウダーフリー手袋で腸を置きます。水分の損失を防ぐために、腸の周りに手袋を折る。 </li><li>脂肪組織を削除し、脾臓を公開。 </li><li>鉗子で大網を視覚化して広げる。 </li><li>慎重に大網にシリコンのポストと、転送を中断からEHTをカット。 </li><li> EHTの周りに大きなomentusをラップと2つのシングル7から0 prolene縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用して修正</li><li>次の腹部に戻して腸を動かす。 </li><li>温めておいた滅菌生理食塩水で腹部をフラッシュします。 </li><li> 6から0 prolene実行中の縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用して腹壁の筋層を閉じます。 </li><li>皮膚を閉じるには、縫合糸を実行している5から0 prolene（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用してください。 </li><li>ラットが麻酔に入れたまま、皮下5 mg / kgのカルプロフェンを注入する。 </li><li>手順のこのタイプ、鎮痛が（そのようなMetamizolなど）3日後に移植のための鎮痛薬のために飲料水（100ml当たり50mgのMetamizol）に追加されるための十分な鎮痛を提供する。 </li></ol> 3。 EHT次の注入の生物発光イメージング IVISのバイオイメージングプラットフォームは（Xenogen、アラメダ、カリフォルニア州、米国）、in vivoで非侵襲的な生物発光イメージングに使用され、結果がIVISのリビングイメージ（Xenogen）ソフトウェアパッケージを用いて分析している。イメージングは​​、術後2時間を開始する毎日実行されます。 誘導チャンバーを用いて - （3％2.5）イソフルランでラットを麻酔。 <ol><li>広くプロボ-ヨウ素を使用して腹部と胸部領域を駆除する、次回の使用の80％エタノール、このステップを3回繰り返します。 </li><li> IP、D -ルシフェリン（375 mg / kg体重Xenogen）を注入</li><li> IVISイメージング室（最大4匹まで同時に解析することができる）に麻酔下のラットを置きます。 </li><li> Lの信号強度を評価するUC +光子/秒/ cm 2で / steridianinベースラインでの関心領域（ROI）（移植後120分）の単位で、日1、2、3、5、7、10時、および週2でEHT内部の細胞、 3と4。ピーク信号を（D -ルシフェリンの注射後20分の周りに表示）に注意してください。 </li></ol>時間をかけて信号強度を示すグラフ（Excel）を作成します。 4。 BLIの結果とELISPOTの相関免疫BNおよび免疫不全ヌードラットの細胞の生体内免疫応答は、EHT移植後に検討した。レシピエント動物の脾臓は、受信者の脾細胞を分離するために5日間EHT移植後に回収した。応答細胞がIFN -γとIL - 4のコーティングを使用して、製造元のプロトコル（BD Biosciences社）に従って行ったとして、ELISPOTアッセイを用いて刺激し、5 × 10 6受信者の脾臓細胞としてEHTsを（シグマアルドリッチ、セントルイス、MO、米国）マイトマイシンを抑制それぞれ、TH1 -、およびTH2応答を調査するプレート。 IFN -γ-及びIL - 4スポット免疫不全モデルに比べて免疫、モデルで有意に高かった（IFN -γ：P = 0.001、IL - 4：P = 0.023;スチューデントt -検定）。 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="図1"> 図1。 BLIの結果とELISPOTの相関が ）免疫ブラウンノルウェーと免疫不全ヌードラットのin vivo免疫応答における細胞は、EHT移植後に検討した。受信者の脾細胞は、5日EHT注入後に回収した。 IFN？とIL - 4の発現は、応答細胞として刺激と5x106受信者の脾細胞としてマイトマイシン禁止EHTを使用してELISPOTアッセイにより評価した。 Th1およびTh2応答はそれぞれ、IFNγとIL - 4産生によって証明されるように免疫不全モデルに比べて免疫モデルで有意に高かった。 B）リュック+ EHTsは、免疫担当BNラットまたは免疫不全ヌードラットのいずれか大きいomentusに移植した。細胞の生存率は、縦方向にBLIが続いた。移植EHTsを拒否した動物の割合が表示されます。細胞はT細胞欠損ラットで生き残ったのに対し、すべてのBNラットは急速に、EHT移植を拒否。

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

心臓修復のためのEHT技術の臨床実施の前に、そのような移植後の細胞とマトリックスの両方のコンポーネントの免疫原性や移植片生存としての基本的な質問は、実験モデルで評価する必要がある。 生体内生物発光イメージングは、移植後のモニタリングの細胞の生存のための有用な新技術を表します。 。我々は正常に確立プロトコル4の適応により、ルシフェラーゼ正（リュック+）心臓の細胞を含むフィブリンベースのEHTを生成する。これらのEHTは、レシピエントラットの大網に移植した。特定の基質（D -ルシフェリン）の腹腔内注射は、IVISのバイオイメージングプラットフォーム（Xenogen）を使用して検出可能であった信号を生成します。接木EHTs内のセルの数の代用パラメータとして役立った光子/秒/ cm 2で / steridianで測定されたベースラインでの信号強度（注入後120分）。移植片生着の非侵襲的な縦assessementに許可される毎日の測定。拒絶反応のモデルでは、時間をかけて信号強度の低下が異なるラット系統における急性拒絶反応の強さと速度と相関していた。

<ul><li> LEW - Tgは（GT（ROSA）26Sor - LUC）11Jmskラット（NBPRのラット番号0299、http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/） </li><li>ウシフィブリノーゲン（ストック溶液：塩化ナトリウム200 mg / mlのプラスアプロチニン5μg/ mlのフィブリノゲン0.9％、シグマF4753） </li><li>マトリゲル（BDバイオサイエンス356235） </li><li> DMEM（生体色素F0415） </li><li>ウマ血清（ギブコ社26050） </li><li>ペニシリン/ストレプトマイシン（ギブコ15140） </li><li>インスリン（Sigma - Aldrich社I9278） </li><li>アプロチニン（シグマアルドリッチA1153） </li><li> D -ルシフェリン（Biosynth L - 8220） </li><li>酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイプレート（Hassa Laborbedarf、S2EM004M99） </li></ul>

エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（eht）のための生物発光イメージング

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

心臓組織工学の様々な技法がネイティブまたはバイオ人工どちら足場材料、などのフィブリンやコラーゲンなどのヒドロゲルにおける心筋細胞の捕捉と筋細胞の単層1のスタッキングを使用して足場の戦略などは過去数十年間で追求されています。これらの概念は、標的の心機能の回復（心筋梗塞後など）で、または実験的なモデル（例えば、予測毒性学と物質のスクリーニングや疾患のモデリング）として目指しています。人工心臓の組織の移植後の細胞生存率（EHT）の正確なモニタリングは、現在、生物発光イメージング（BLI）のテクニック2 -生体内で使用可能となった。ここでは、ホタルルシフェラーゼのユビキタス発現（、3 ROSA /ルシフェラーゼ- LEW Tg）を持つトランスジェニックラット系統からフィブリンベースのEHTの生成を説明します。注入はEHTの移植後の宿主の免疫応答を評価するために別のラット系統の大網に実行されます。 BLIと酵素結合免疫スポット法（ELISPOT）によって生成された結果の比較は、免疫応答の評価のためのBLIの有用性を確認する。

このビデオはの使用方法を示しています<em&gt; in vivoで</emラットにおけるエンジニアの心臓組織（EHT）の移植後の免疫応答を研究する&gt;生物発光イメージング。

エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（EHT）のための生物発光イメージング

過去数十年にわたり、天然または人工のいずれかを用いた足場材料戦略を含む、心臓組織工学のさまざまな技術が追求されてきました。

本実験の全体的な目的は、生体内生物発光イメージングを用いて、ラットへのエンジニアードハートティッシュ（EHT）移植後の免疫応答を研究することである。まずルシフェラーゼ陽性のEHTを作製し、次にルシフェラーゼを安定的に発現するEHTをレシピエントラットの大網に移植することで、これを達成する。その後、レシピエント動物に対してin vivo生物発光イメージングを行い、非侵襲的な縦断的EHT生存および拒絶反応のモニタリングを行うことができます。このモデルを用いることで、例えば急性拒絶反応の強度やキネティクスを、時間の経過に伴う生物発光信号強度の低下と相関させることが可能です。組織学などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、日次での測定により、移植片生存の非侵襲的な縦断的評価が可能になることです。この手法は、エンジニアリング心臓組織の生存および拒絶反応に関する知見を提供しますが、他の課題にも適用可能です。例えば、EHTの代謝などが挙げられます。本手法については、日常的にこの操作を行っているChristiana Parmanが実演します。私の研究室では、まずLucierease Lu新生ラットから形質転換心細胞を単離し、移植目的のフィブリンベースのDHTを作製します。新生Luciferase Lu形質転換ラット心臓から単離した細胞、ウシフィブリノゲン、およびMatrigelを含むマスターミックスをX-D-M-E-MおよびNKMで調製します。6ウェル培養プレートの各ウェルに2%アガロース/PBS溶液を9 mLずつ加え、テフロン製スペーサーをウェルに配置して、アガロース鋳型を準備します。アガロースが凝固した後、スペーサーを取り除き、ポストが鋳型に届くようにシリコンポストラックを培養プレート上に配置します。EHTを生成するには、まずマスターミックスをやさしく混ぜ、計算した量のトロンビンをマスターミックスに加えて短時間混合します。次に、1100 microlitersのマスターミックスを各モールドに迅速にピペッティングします。フィブリノゲンが重合した後、EHTが付着したポスト付きラックをアガロースキャスティングモールドから慎重に取り出し、1ウェルあたり8 millilitersの特製培地を含む新しい6ウェル細胞培養ディッシュにラックを移します。EHTを37 °C、7% 二酸化炭素の細胞培養インキュベーターで10日間維持します。また、培地交換を週に3回行います。この培養期間中に、新生ラット心細胞は伸長し、相互に連結し、シリコンポスト間の力線に沿って整列し始めます。移植時に、自発的な同期収縮が観察されます。手術器具は使用前にオートクレーブで滅菌し、滅菌生理食塩水 30 milliliters を温めておきます。移植に使用するラットは、体重 100 から 150 grams であり、標準的なラット飼料と水を自由摂取（ad libido）させて慣習的な条件下で飼育してください。このビデオでは、麻酔をかけたブラウンノルウェーラットを使用します。手術前にラットを鎮静させ、麻酔下で足指をつまんでも反応がないことを確認して鎮静を確認します。体重1kgあたり5mgを後肢の皮下に注入し、腹部を剃毛し、動物の眼球の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。麻酔中にベタジンを用いて腹部を消毒し、続いて80%エタノールで清潔な領域から汚染された領域に向かって拭き取ります。この消毒工程を繰り返します。3回足踏みし、動物をドレープし、正中線に沿って腹部切開を行い、皮膚と筋肉を2段階に分けて分離して腹腔を開きます。切開の間には、器具をホットビーズ滅菌してください。パウダーフリーの手袋を生理食塩水で湿らせます。腸をグローブの中に入れます。水分の喪失を防ぐため、グローブを腸に沿って折り畳みます。切開部を広げ、脾臓を露出させます。ピンセットで大網を同定し、広げます。吊り下げ用のシリコンポストからEHTを慎重に切り離し、大網の上に移動させます。大網でEHTを包み、2本の7-0 Prolene単糸縫合糸を用いて固定します。次に、腸を腹腔内に戻します。あらかじめ温めておいた滅菌生理食塩水 1 mL で腹腔内を洗浄します。腹壁の筋肉層を 6-0 Prolene の連続縫合で閉鎖します。この種の処置に十分な鎮痛効果が得られるよう、5-0 Prolene 走行結節縫合を用いて皮膚を閉鎖します。移植後3日間、飲料水に 50 mg/100 mL の割合で添加します。非侵襲的な in vivo 生体発光イメージングには IVIS Bioimaging プラットフォームを使用し、結果は IVIS Living Image ソフトウェアを用いて解析します。パッケージのイメージングは、術後2時間後から毎日行います。EHTの生物発光を可視化する前に、ラットを麻酔し、足指での刺激により鎮静状態を確認します。腹部をピンチ消毒します。ルシフェリンを初回 375 mg/kg の体重量で投与し、麻酔をかけたラットを IVIS イメージングチャンバー内に配置します。最大4匹のラットを同時に解析することが可能です。IVIS 生体イメージングソフトウェアを使用して、ルシフェリン投与から約20分後に現れるピーク信号を観察し、記録します。次に、植え込み後120分、および1、2、3、5、7、10日後、さらに2、3、4週後の関心領域において、EHT内部のルシフェラーゼ陽性細胞のベースライン信号強度を、photons per second per centimeter squared per Ceridianの単位で設定します。データは、信号強度の経時変化を示すグラフ形式で表現できます。免疫能を有するBrown Norwayおよび免疫不全マウスにおける細胞性のin vivo免疫応答を（解析します）。ヌードラットを用いた検討を行い、EHT移植の5日後にレシピエントのSP細胞を回収した。ミトマイシン処理したEHTを刺激細胞として、レシピエント細胞 5 × 10⁶ 個を応答細胞として用い、LISA法によりインターフェロンγおよびIL-4の発現を評価した。インターフェロンγおよびIL-4の産生量に基づくと、免疫不全モデルと比較して、免疫正常モデルにおいてTh1およびTh2応答が有意に高かった。LUCIFERASE陽性のEHSを、免疫能を有するPNラットまたは免疫不全ヌードラットの大網に移植した。細胞の生存をBLIにより経時的に追跡した。移植されたEHSを拒絶した動物の割合を示す。すべてのBNラットはEHT移植片を速やかに拒絶しましたが、T細胞欠損ラットでは細胞が生存しました。手術手技を習得すれば、適切に実施することで数分以内に完了させることができます。細胞浸潤や体液性免疫応答に関するその他の疑問を解決するために、免疫学的アッセイや組織学的解析などの他の手法を用いることができます。

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