Name: 解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: 学ぶマウスの末梢リンパ節解剖と2光子イメージングによるCD4+T細胞運動性可視化手法。免疫応答におけるリンパ球動態の理解に貢献する。

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我々は、試薬の準備の支援のためにレベッカのPaquetteを感謝します。 MPMは、国立衛生研究所からの補助金からの健康と支援の国立研究所GM - 41514（MDC）、NS - 48252（KGC）、GM - 48071（IP）からルースL. Kirchstein博士号を取得する前のフェローシップでサポートされています。

1。細胞の養子移入： 尾静脈または眼内注射は、細胞の導入トラッカー標識または蛍光タンパク質を発現するリンパ球の両方に適した方法である。このビデオで。我々は、尾静脈注射によって細胞の養子移入を示しています。 A.材料 CD4 + T細胞を37℃で30分間、1.4μMのCFSEで標識されていますが、2回洗浄し、RPMI - 1640の100μLに再懸濁した。細胞は、無菌の注射用28ゲージのインスリン注射器にロードされます。使用する細胞の数は、実験が行われているに依存します。通常は、500万T細胞は、単純なT細胞の可視化のために十分です。マウスのための齧歯類の現像抑制剤は、動物に、自分自身への負傷を​​防止するために必要とされる。 B.動物の保護マウスをゆっくり（ビデオを参照）げっ歯類の制止する人に動物をバックアップし、静かにプランジャーを押すことにより管の開放端を閉じることによって養子移入のために確保される。いくつかの小さな動物が制止する人の内部に好転することができるように、このプロセスの間にマウスの尾から行くようにしてください。このメソッドは、自分自身を傷つけるからと注入中に移動するから動物を防ぐことができます。げっ歯類の現像抑制剤をセットアップするとき、前方にジャンプするから動物を保つために必要であるよりも、さらににプランジャーを押さないでください。また、動物に対してプランジャーを押したりしないで、そして時間の長時間制止する人に動物を放置しないでください。 C.尾静脈の可視化軽く軽く、人差し指を介してラップし、親指で指の内側に対して保持されるようにあなたに向かって尾を引く。直立テールのどちらかの側にある尾静脈を識別します。可視化は、その後、エタノールでダウン拭き取り、ぬるま湯で尾を暖めることによって促進される。 D.細胞の注入静脈が位置しているときは、静脈に浅い角度で平行にシリンジのベベル面を上に挿入する。一回静脈内、静かにプランジャーを押し下げて、あなたが静脈にある場合は注射への抵抗はないはずです。何らかの抵抗がある場合は、シリンジを取り外して、別の場所でもう一度試してください。 あなたが静脈内にある場合、注入が完了するまで、ゆっくりとプランジャーを押し下げる。尾は、注入時に膨張になってはいけません。その場合、これは針が静脈内にないことを意味します。注入中に静脈を&quot;失う&quot;ことが可能です。このような場合は、針を取り外して、別の場所で注射をしてみてください。複数の注射をしようとする必要がある場合、それはオリジナルの注射部位からのマウスの体に向かって尾を上下に移動するのが最善です。養子移入におけるもう一つの試みのために自分で部屋を与えるためにテールに遠位に起動して、この可能性のために将来の計画を立てる。 E.ポスト噴射の考慮事項注入が完了した後、静脈からの血液の小さな逆流が発生します。静かに出血が停止するまでクリーンワイプで注射部位を押してください。プランジ​​ャーを外し、ゆっくりと尾部に保持している間、動物は、制止​​する人のうち、前方に歩いてみましょう。 常にあなたが従っているを確認するために、動物のケア委員会および動物使用のプロトコルを確認してください。実際の実験を試みる前に、このテクニックを数回練習することが重要です。 2。リンパ節の分離二光子イメージングのためのリンパ節の分離は、周囲の組織から適切なリンパ節を慎重に除去する必要があります。 A.選択し、末梢リンパ節の位置イメージングのためのリンパ節の選択は、実験目的に依存します。局所感染または射出所属リンパ節に注意してください、とイメージングのための適切なノードを選択します。ヴァンデンブルークらの論文は。、詳細3のマウスリンパ節の位置と形態を説明しています。このビデオでは、我々は細胞の分離やイメージングに適している6大末梢リンパ節の切除を示しています。 B.リンパ節の除去： リンパ節を除去しながら心に組織の整合性を保つ。しない破裂カプセルを、または任意の方法の損傷リンパ節の構造に注意してください。リンパ節の構造的完全性の損失は、実験が損なわれます。必要に応じて、解剖顕微鏡下で解剖細かい（＃5デュモン）ピンセットでリンパ節の表面から脂肪を取り除く。リンパ節は、これは光を散乱によるイメージングを覆い隠すので、ノードの表面上に残りの脂肪を含んではならない。 リンパ節の適切な切除はまた、最初の本当の実験の前に練習する重要な手法です。 3。リンパノッド電子イメージングセットアップと注意事項リンパ節は、この場合には埋め込み式のチャンバーから構成される画像処理の段階、に保護する必要があります。暖め、酸素灌流メディアは、蠕動ポンプとインラインヒーターを使用して1つの側面からチャンバーにポンプでくまれ、そして廃棄物収集フラスコに真空管と収集チャンバ内へ下降傾斜チャネルを介してそれが終了します。私たちのシステムでは、リンパ節は、Cメディアは、37℃で浸漬されており、医療グレードのcarbogen（5％CO 2、95％O 2）と超灌流。可能な限りそのまま灌流媒体の温度は、リンパ節の近くに記録されるべきである。特定のシステムでは、メディアの流量と舞台デザインのバリエーションは、顕微鏡ステージと客観的に対応するために必要となる場合があります。 A.リンパ節イメージングセットアップ： としてビデオに示すように、我々は適切なサイズにカットプラスチックカバースリップに（正立顕微鏡を使用して画像TまたはB細胞のゾーンへの）ダウン髄質側は、最初にそれを添付してリンパ節を固定します。無毒の組織接着剤を（我々は3M社からVetBond™を使用する）使用することが重要です。 カバースリップは、イメージングチャンバーのガラスのベースにこれを付着、カバースリップの下側にシリコーングリースの小さい軽打を配置することによって、流れる媒体に固定されています。 B. 2光子イメージングの考慮事項： いくつかの要因は、リンパ球が動いて停止することができます：高すぎるまたは低すぎる温度、過剰なレーザーパワー、圧縮またはリンパ節へのその他の損傷、及び酸素の欠乏を。過度のレーザパワーや温度による損傷&gt;〜39℃の不可逆的である。 細胞が薄暗いであれば、それはむしろ、細胞を可視化するためにより高いレーザパワーを使用するよりも検出器のゲインまたは細胞標識のプロトコルを増加させるほうがベターです。蛍光タンパク質のラベルまたは式の最適化は、バックグラウンドの自家蛍光のレベル以上の蛍光をもたらすために必要となる場合があります。合理的なゲインおよびレーザパワーの設定では、ベースライン上の蛍光の約2ログのシフト（フローサイトメトリーで測定した）細胞の可視化のための合理的です。 調整可能な二光子レーザーで、励起に使用される波長は、撮像される蛍光体の二重単一光子励起の最大値より少し小さくする必要があります。複数のラベルまたは蛍光タンパク質を用いて二光子実験ではそれは両方のラベルの最適な設定を見つけるために使用される励起波長を実験する必要があるかもしれません。二光子励起は、本質的な青色の第二高調波発生を利用することによって画像内因性のコラーゲンの構造に使用することができます。第二高調波発生（SHG）は、2つの光子が物質内で結合されている場所で発生し、元の光子の2倍の周波数の単一光子を放出する。組織では、二光子励起では入射レーザー光は、コラーゲンのような高度に秩序化されたタンパク質の構造に垂直な場合に発生します。 二光子励起イメージングに関する実務的な問題は、プレビューのレビュー4、5で議論された。

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

このビデオプロトコルでは、養子細胞移入と末梢リンパ節のイメージングリンパ球の運動性に必要なリンパ節の分離と準備するための手順を示しています。二光子イメージングには、外植組織（ここに示されている）の両方でと生体製剤における共焦点イメージングに比べていくつかの利点があります。特に、光散乱を最小限に抑え、リンパ節被膜下イメージング〜300マイクロメートルを可能にするといくつかの組織4の深い赤外励起の使用。また、多光子励起は、漂白写真と焦点面の側面から組織の損傷を最小限に抑え、目標の焦点に制限されています。あらゆる新技術と同様に、しかし、二光子イメージングは、万能薬ではないとその限界と潜在的な落とし穴が念頭5に保持する必要があります。興味のコラーゲン細胞を蛍光外因性のプローブによって、または蛍光タンパク質の発現によってラベル付けされている必要がありますがそのような第二高調波発生などの内因性シグナルを除いて - これらの中でその要件です。真実にそれらがに浸漬されているのに対し、構造要素と無数の他のラベルの付いていない、目に見えない細胞の複雑な環境と相互作用し、印象は、このように、これらの標識細胞が黒色無効に泳いでいることが作成されます。 免疫学への二光子イメージングの導入以来6年で、この手法は、直接細胞間相互作用、細胞の運動性と局在、細胞のシグナル伝達経路と細胞傷害性細胞を含む無傷の生体組織のプロセスで視覚化することによって長年の疑問を解決するための研究を可能にしたイベントを殺す。フィールドは急速に初期の現象論的説明を越えて進化している、とコンピュータモデリングとシミュレーションと一緒に定量分析は、現在、リンパ節内で明らかに混沌とした細胞の動きとの相互作用が効率的な免疫応答を導く方法の意味を理解し始めている。この進展は、総合的にimmunoimagingの2光子顕微鏡のアプリケーションを記述する100以上の論文をリスト最近の出版物1に見直される。

解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答1の開始時の運動性と細胞間相互作用の優雅な振り付けを明らかにした。ここで、我々は、標識されたT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 + 2002年2で説明したように植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入するための方法を提示する。免疫細胞の二光子励起イメージングは​​、細胞を蛍光セルトラッカーの色素で染色することによりまたは蛍光タンパク質を発現するかして、ラベル付けされている必要があります。我々は、約15-30分内リンパ器官には、自宅レシピエント動物の尾静脈にドナーマウス由来の細胞を注入するの養子移入の手順を示しています。我々はリンパ節の分離を示し、摘出したリンパ節の実装を適切に確保するための方法を説明します。このような適切な灌流メディアの酸素、温度、およびレーザパワーのような他の考慮事項が説明されています。最後に、我々はナイーブCD4の3D映像+ 37℃で定常状態の運動性を示すT細胞を提示℃に

二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答1の間にリンパ球運動と細胞間相互作用を明らかにした。ここで、我々はT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 +植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入を示しています。

2光子イメージングにより、基底状態および……におけるリンパ節内の運動性と細胞間相互作用のエレガントな連動（コレオグラフィー）が明らかにされてきた。

こんにちは、メラニー・マシューです。カリフォルニア大学アーバイン校のMicah Helen研究室に所属しています。本日は、in situ 2-photon imagingを目的として、マウスからリンパ節を摘出する方法について説明します。これには、鼠径リンパ節、腋窩リンパ節、および頸部リンパ節の摘出が含まれます。マウスにおいてアクセスしやすい6つの末梢リンパ節を使用します。マウスのリンパ節に蛍光細胞を導入し、2光子イメージングで観察するためには、まず蛍光標識した細胞の養子移殖を行う必要があります。それでは、この実験では、まず養子移入（adoptive transfer）について説明します。こちらが28ゲージのインスリン用注射器です。これに細胞を充填します。まず、シリンジがスムーズに動くように、詰まりを取り除きます。次に、慎重に細胞を充填します。インスリンシリンジでチューブの側壁に触れないよう細心の注意を払います。側壁に触れると針先が鈍くなり、マウスの尾静脈への注入が困難になるためです。気泡がある場合は、軽く叩いて気泡を追い出し、邪魔にならないようにします。ここで軽く叩いて取り除きます。これで完了です。これで、これらの細胞を尾静脈に注入する準備が整いました。それでは、こちらのC 57 black sixマウスを使用します。マウスをゆっくりと、優しく尾静脈注入器の中に後退させます。多くのマウスはこの処置を嫌がりますが、実際の注射時にマウスが跳ねて自傷したり、術者が針刺し事故に遭ったりすることを防ぐために必要です。そのため、ゆっくりとマウスを固定します。次に、マウスの尾の両側にある尾静脈を探します。上部に太い動脈が走っています。そしてマウスの尾の両側には、先端まで伸びる2本の長い静脈があります。針を持ち、尾の低い位置から静脈を探します。ここに静脈が見えます。エタノールで軽く湿らせると、より鮮明に視認できるようになります。それでは、尾静脈への注射を行います。針の切断面（ベベル）を上に向けた状態で保持することが重要です。つまり、針の開口部を上に向けます。そして、尾とほぼ平行に針を刺入してください。静脈がすぐ表面にあるため、角度をつけて刺すのは避けてください。針を尾静脈に非常にゆっくりと滑り込ませます。経験を積めば、針が入っていく感覚がわかるようになるはずです。ただし、最初の数回は液体を押し込み、抵抗がないか確認してください。抵抗がなければ尾静脈に入っているため、今行ったように迅速かつ簡単に注入できます。その後、ゆっくりと針を抜いてください。静脈に入っていることを確認するもう一つの方法は、逆流によって少量の血液がにじみ出ることです。注入部位から少量の血液が逆流してくることが確認できれば、確実に尾静脈に入っていると言えます。また、注入後すぐにマウスの出血は止まるはずです。それでは、こちらがC57BL/6マウスです。このマウスからリンパ節を摘出します。まず、こちらの鼠径部、および腋窩にある腋窩リンパ節を摘出します。反対側も同様です。次に、喉のあたりにある浅頸リンパ節を、左右それぞれ1つずつ摘出します。こんにちは。それでは、マウスの解剖に移ります。まず、マウスを解剖ボードにピンで固定することから始めます。このようにして、マウスを固定してください。ピン留めを確実に行う必要があります。これにより、末梢リンパ節をより適切に露出させることができます。そのため、通常は4つの肢すべてをピンで固定します。尾については気にしません。尾をピンで固定することを好む人もいます。そして、解剖部位に被毛が入り込み、リンパ節や器具に付着するのを防ぐため、マウスに70% ethanolをスプレーします。マウスをエタノールで消毒しましたので、正中線に切開を加えます。体から被毛をかき分けて行います。このように皮膚を持ち上げて、小さなテントのような形にして切開します。そうすることで、今回のケースでは避けるべき腹膜を切開することを防げます。それでは、ここから正中切開を開始します。小さく切開し、腹膜まで達していないことを確認します。下に腹膜が見えます。切開部の下にハサミを滑り込ませ、皮膚と腹膜をゆっくりと剥離していきます。頸リンパ節を採取するため、切り進めながら小さく切開を加えていきます。主要な血管を傷つけないよう、非常に慎重に、かつゆっくりとマウスの下顎線まで切開します。次に、皮膚フラップの下部に位置する鼠径リンパ節を採取するため、正中線に沿って尾の付け根付近まで切開します。これで、適切な正中切開が完了しました。それでは、皮膚を腹膜から分離します。ピンセットを使用して、皮膚を腹膜から慎重に剥がしていきます。これで、最初に解剖するリンパ節を露出させます。こちらは下方の皮膚フラップにある鼠径リンパ節です。マウスの本体から皮膚フラップを剥離させましたので、これをピンで固定して鼠径リンパ節を露出させます。これで鼠径リンパ節がより明確に露出したので、きれいに摘出することが可能になります。ピン留め後、このように鼠径リンパ節が露出しています。通常、脚のすぐ上の皮膚フラップ内に見られます。その上を走る血管のY字型の分岐点を確認することで見つけることができます。これで完了です。少量の脂肪に包まれ、その上に血管が走行しています。それでは、これから鼠径リンパ節を摘出します。ピンセットをリンパ節の両側に沿って滑らせ、脂肪から引き離します。脂肪が混入してはいけません。2光子イメージングを行う際、脂肪があると組織へのレーザー浸透が妨げられるためです。さて、リンパ節からすべての脂肪を丁寧に取り除くことと、リンパ節の皮質を損なわずに保持することが重要です。よし、これでいいでしょう。こちらが分離したリンパ節です。これを培地に投入します。脂肪が完全に除去できているかを確認する良い方法は、リンパ節が沈むかどうかを見ることです。培地に入れた際、底まで真っ直ぐに沈めば除去できています。脂肪があれば、表面に浮いてきます。それでは、次に腋窩リンパ節を取り出します。これはマウスの腋窩の、主要な血管に沿った位置にあります。出血が多く、リンパ節が隠れてしまうことがあるため、難しい場合があります。そこで、私が実際に行っている方法をご紹介します。今回は出血がないことを願っています。まず、皮膚フラップを切り開きます。実際には、採取したいリンパ節の隣の前腕部を切り開きます。これにより、指を使ってより器用に皮膚を剥離させることができます。脇の下を走るこの筋肉を保持し、軽く引っ張ると、腋窩リンパ節が飛び出してきます。今から探してみます。ありました。主要な血管に沿った脇の下のちょうどそこにあります。それでは、腋窩リンパ節を剥離します。皮膚を再びピンで固定しても、指で保持しても構いません。ご自身がやりやすい方法で行ってください。私は慎重に作業することを好みます。このリンパ節の周囲には脂肪がほとんどないため、イメージングには適していますが、主要な血管に隣接しているため、不注意に扱うと見失うことがあります。したがって、腋窩リンパ節については、周囲の結合組織を掴み、血管からゆっくりと分離させていきます。はい、これで分離できました。こちらが腋窩リンパ節です。ちょうどここにあります。細長く平らな形状のリンパ節です。そして、リンパ節本体を損傷させないよう、リンパ節の側面に残っている結合組織を少しつまんで保持します。リンパ節を水和状態に保つためにイメージングを行います。施設のイメージングを行う前に、鼠径リンパ節、腋窩リンパ節、および頸部リンパ節を区別して管理できるよう、個別のチャンバーに入れたCO2独立培地に配置します。リンパ節の作製が適切にできたかを確認する方法は、解剖して取り出した後に底に沈むかどうかで判断できます。底に沈むということは、リンパ節内に脂肪がほとんど含まれていないことを意味します。それでは、頸部リンパ節（浅頸リンパ節）を取り除きます。まず、腋窩リンパ節を摘出した際のピン留めをやり直し、頚部組織をより明確に露出させます。頚部リンパ節はマウスの顎筋の近く、具体的にはその側面に沿って位置しています。これらは、体調を崩したときに触れることができるのと同じリンパ節です。風邪を引いた際に医師が触診する部位にあたります。この操作を行う際は、通常、組織の下に指を差し込んで前方に引き出しながら、ピンセットを側面に沿って滑らせるようにします。リンパ節が飛び出してくるはずです。あ、ありました。組織の上にあります。ここにあります。これが表在頸リンパ節です。唾液腺を採取しないように注意してください。唾液腺にはT細胞は存在しません。一方で、これらの特定のリンパ節には、CFSEで標識されたCD4陽性T細胞が含まれています。そこで、組織内を移動するこれらのT細胞のインサイチュ（in situ）ビデオをお見せします。それでは、リンパ節を破損しにくいプラスチック製カバーガラスに接着し、in situイメージングステージの底部に固定します。これにより、T細胞のイメージング中に組織が動いたり、組織ドリフトが発生したりするのを防ぐことができます。ここに、破損しにくいプラスチック製カバーガラスを用意しています。まず、リンパ節に適したサイズに一方をカットします。ハサミを使って、ここで小さな正方形に切り取ります。それでは、ここに接着剤を塗布します。少量の接着剤を使用します。カットしたスライドピースの周囲に塗布してください。その後、キムワイプを使用して、余分な接着剤を吸い取ります。これは結節を覆うための接着剤です。イメージングの妨げにならないよう、ごく薄い層にする必要があります。次に、溶液からリンパ節を取り出します。まず、培地から1つ目のリンパ節を取り出します。この操作は慎重に行ってください。リンパ節の皮質を損傷させないように注意してください。リンパ節の端だけを掴み、まずリンパ節の角をスライドにそっと触れさせてから、リンパ節をスライド上で引きずるようにして固定し、接着させます。ここでは、リンパ節の端に残っていたごく少量の脂肪を利用しました。これにより、リンパ節の皮質を乱することなく固定できています。次にリンパ節を取り出し、接着剤を硬化させるために、取り出した時と同じウェルに浸します。ウェルを逆さまにし、接着剤を含む培地の中にゆっくりと浸します。硬化したexo glueを少量取り除きます。これで完了です。これで、2光子イメージング用のリンパ節の準備が整いました。以上が、in situ 2光子イメージングに向けたリンパ節の調製方法です。それでは、これらを顕微鏡に載せてセットアップし、養子移入したT細胞の優れた画像を撮影します。ここでは、鼠径リンパ節内で移動するCFSE標識T細胞を示しています。このビデオは約500倍に加速されており、細胞が非常に高い運動性を持っていることがわかります。20 xの水浸対物レンズを用いて、約20 xで倍率を上げています。これはT細胞の移動のみを示した例です。周囲の細胞には染色を施していません。通常、より高度な2光子励起実験では、染色した樹状細胞、染色したB細胞およびT細胞が、染色したNK細胞と相互作用している様子を観察できます。リンパ節内で想定されるほぼあらゆる細胞種をラベル化し、イメージングすることが可能です。以上で、当研究所のリンパ節イメージングプロトコルを終わります。

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

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Biology

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