共刺激シグナル遮断によるアロ抗原刺激によるヒト末梢血単核球のアロ抗原特異的アネルギーの誘導

本実験の全体的な目的は、抗原提示細胞によるT細胞のCD 28受容体を介した共刺激を阻害する抗体が存在する状況下で、レシピエントの同種抗原を用いてex vivo刺激を行い、レシピエント同種特異的ドナーT細胞を活性化させることです。これは、まず2人の異なる健康なドナーからPBMCを分離することによって達成されます。次に、CD 28刺激を遮断するために、リガンドB 7.1およびB 7.2に対するモノクローナル抗体存在下で、HLA不適合のPBMC集団をインキュベートし、バルク同種活性化共培養を構築します。

次に、同種刺激による活性化の有効性を、一次および二次混合リンパ球反応（MLR）によって測定します。最後に、第三者およびCMV特異的な反応を決定することで、同種刺激による活性化の同種特異性を測定します。その結果、ドナーT細胞はその後と同種抗原刺激に対して低反応性になりますが、非同種反応性のドナーT細胞は損なわれず、機能が維持されることが示されます。

私たちは、HLA不整合幹細胞移植の最中および移植後に、allo energized（アロ・エナジャイズ）したドナーT細胞を輸注するという戦略を、過去および現在進行中のパイロット臨床試験で成功に導きました。その結果、未操作のHLA不整合移植を受けたレシピエントの過去の対照群と比較して、免疫再構築の改善、感染症の減少、ならびに急性および慢性移植片対宿主病の重症度の低下が観察されました。allo anodization（アロ・アノダイゼーション）戦略の大きな利点は、この手法が病原体特異的または腫瘍関連抗原特異的なT細胞応答を減少させず、またドナーT細胞プールからCD4調節性T細胞を除去しないため、オフターゲット効果が最小限に抑えられることです。この手順の実演を行うのは、当研究室のスタッフサイエンティストであるChristine Vinです。最初のステップは、2人の健康なボランティアドナーから採血することです。

あるドナーからの細胞をレスポンダーとし、別のドナーからの細胞をスティミュレーターとして使用します。次に、Ficoll-Paqueを用いた密度勾配遠心法により、血液からPBMCを分離します。少量の細胞をトリパンブルーで染色し、ヘモサイトメーターを用いて生存PBMC数をカウントします。

各ドナーから得られたPBMCを、10 mLの完全培地を用いて、1 mLあたり100万個の生存細胞となる濃度で、別々の15 mLコニカルチューブに分注します。バルク同種活性化共培養を構築するため、ドナーPBMCの一方のチューブを刺激細胞、もう一方を応答細胞として指定します。

刺激細胞用として指定した15 mLチューブに、anti B 7.1およびanti B 7.2抗体を100 µgずつ加えます。チューブを静かに撹拌し、30分間インキュベートします。インキュベーション期間後、刺激用PBMCに放射線を照射し、ガス透過性キャップ付きのT 25 50 cm³細胞培養フラスコに加えます。

フラスコに「bulk allo coal culture」とラベルを貼ります。次に、完全培地を用いて濃度1 million/mLに調製した他ドナー由来のレスポンダーPBMCを10 milliliters、フラスコに加えます。さらに、antib 7.1およびAntib 7.2抗体をそれぞれ100 microgramsずつフラスコに加え、静かに混合した後、フラスコを垂直に立てた状態でインキュベーターに入れ、72時間培養します。

次に、ブロッキング抗体を用いないバルクコントロール共培養のため、刺激細胞側のPBMCをさらに1,000万個照射し、T 25 50 cubic centimeterセルカルチャーフラスコに加えます。フラスコに「bulk control co-culture」とラベルを貼ります。バルク同種活性化共培養に使用したものと同じ応答細胞側のPBMCを、完全培地を用いて1 million per milliliterの濃度で10 milliliters加え、軽く混ぜ合わせた後、フラスコを垂直に立ててインキュベーター内で72時間培養します。

次のステップは、バルク共培養を開始したと同日に、アロエナジー化ドナーT細胞プールの機能を測定することです。測定予定の3つの時点それぞれについて、96ウェルU底プレートを用いて一次MLR（混合リンパ球反応）を準備します。その後、バルクコントロールおよびアロエナジー化共培養のそれぞれから5 mLをデカンテーションし、15 mLチューブに移します。

次に、各チューブから200 µLの細胞懸濁液を、3枚のプレートそれぞれの3連ウェルに分注します。バルクコントロール低温培養細胞由来のウェルには「共刺激遮断なし」または「no CSB」とラベルを付け、バルク同種活性化低温培養細胞由来のウェルには「CSB」とラベルを付けます。その後、陰性対照として、各プレートの6つのウェルに200 µLの完全培地を加えます。

最後に、蒸発を抑えるため、すべての空のウェルに200 µLのPBSを加え、バルク共培養のセットアップから72時間後にプレートをインキュベーターに入れます。測定する3つの各タイムポイントについて、「UBO 96ウェルプレート 二次MLR」とラベルを貼ったプレートを用意します。二次MLR用のレスポンダー細胞を準備するため、バルクコントロールおよびアロ・エナジャイジング共培養のそれぞれから5 mLを15 mLチューブに移し、室温で2000 RPMで5〜10分間遠心分離します。その後、上清を慎重に吸引し、ペレットを再懸濁させ、各チューブに10 mLの完全培地を加えて、2回さらに洗浄し、2回目の洗浄後にもう一度細胞を遠心分離します。

細胞を1 mLの完全培地で再懸濁します。トリパンブルー染色を用いて生存細胞数を算出し、細胞濃度を1 mLあたり100万個の生存レスポンダー細胞に調整します。各チューブから100 µLの細胞懸濁液を、各プレートの3つのウェルにピペッティングして分注します。

これらのウェルに「第一者（first party）」または「FP合金刺激（FP alloy stimulation）」とラベルを貼ります。次に、各チューブから100 µLの細胞懸濁液を各プレートの別の3つのウェルにピペットで分注し、これらのウェルに「CD 3/28 刺激」とラベルを貼ります。PBMCは、allo用の第一者刺激PBMCを供給したのと同じドナーから使用します。刺激細胞として活性化およびコントロールの共培養を用います。二次MLR用に、第一者ドナーのPBMC 10 millionを1 million/mLの濃度で懸濁させ、放射線照射を加えます。

各二次MLRプレートのfp allo restimulationとラベルされたウェルに、放射線照射した刺激細胞を100 µLずつ加えます。陽性対照として、各二次MLRプレートのCD 3 28 stimulationとラベルされたウェルに、CD3およびCD28モノクローナル抗体を各1 µL、および完全培地を98 µL加えます。さらに、陰性対照として各プレートの空ウェル6つに完全培地を200 µLずつ加え、蒸発を抑えるためにすべての空ウェルにPBSを200 µLずつ加えます。

プレートをインキュベーターに入れます。次のステップでは、サードパーティドナーと呼ばれる新しい健康なドナーから単離したallo PBMCを用いて、二次混合リンパ球反応（MLR）によるalloプロセスの特異性を測定します。サードパーティPBMCを1 million cells/mLの密度で懸濁し、二次MLR特異性試験用の3枚の96ウェルプレートに分注して、3日目、5日目、7日目に放射線照射ラベルを行います。

特異性を測定するための二次MLRに向けてレスポンダー細胞を調製するには、バルクコントロールおよびアロ刺激共培養液からそれぞれ5 mLを15 mLチューブに移し、2000 RPMで5～10分間遠心分離します。次に、上清を慎重に吸引し、ペレットを再懸濁させ、各チューブに10 mLの完全培地を加えて、2回目の洗浄後にもう一度遠心分離することで、細胞を2回洗浄します。最後に、細胞を1 mLの完全培地で再懸濁します。

トリパンブルー染色を用いて細胞数をカウントし、生存応答細胞の濃度を1 mLあたり100万個に調整した後、各チューブから100 µLの細胞懸濁液を各プレートの3反復ウェルに分注します。これらのウェルにTPまたはサードパーティ同種刺激（third party allo stimulation）とラベルを付けます。次に、TP同種刺激とラベル付けしたウェルに、放射線照射したTP刺激細胞を100 µL添加します。

病原体に対するアロ反応の特異性をさらに検証するため、CMVに対して既知の増殖反応を示すドナーから得られたPBMCをエネルギゼーションした後、反応を測定します。ウェルプレートに「secondary M-L-R-C-M-V day three, five and seven」とラベルを貼り、バルクコントロールおよびアロエネルギゼーション共培養物からそれぞれ5 mLを15 mLチューブに移します。その後、細胞を洗浄・カウントし、完全培地を用いて1 million/mLの濃度で再懸濁します。各チューブから細胞懸濁液100 µLを各プレートの3つのウェルに分注し、これらのウェルに「CMV stimulation」とラベルを貼ります。

次に、「CMV刺激」とラベルされたウェルに、完全培地100 µLで希釈したCMVライセート0.1 µLを添加します。続いて、陰性対照として各プレートの6つのウェルに完全培地200 µLを添加します。最後に、蒸発を防ぐためにすべての空のウェルにPBS 200 µLを添加し、プレートをインキュベーターに入れて、一次および二次MLRにおける増殖を測定します。

プレートの回収の16時間前に、陰性対照および細胞を含むウェルに1 µCiのトリチウム標識チミジンを添加する。TomTecハーベスターまたは同様の装置を用いて、各プレートにつき1枚のフィルターマットにチミジンを回収する。フィルターマットを1時間乾燥させる。

次に、それらを個別のサンプルバッグに入れます。各バッグに5 mLのシンチレーション液を加え、封印します。HLA不一致の刺激細胞および応答細胞のPBMCを用いて、Wallachマイクロベータシンチレーションカウンターまたは同等品でフィルターマットを読み取り、実験の最後の16時間におけるトリチウムチミジンの取り込み量を測定します。

この図から、一次MLRにおいて共刺激遮断が存在すると、5日目におけるレスポンダーPBMCの平均アロ増殖が、共刺激遮断のない対照一次MLRで観察された値の約30%まで減少することがわかります。これは、5日目における一次アロ増殖の平均抑制率が約70%に相当することになります。この図に示されている通りです。

この図から、5日目の二次MLRにおいて、allo energized PBMCの第一者同種増殖は、通常、コントロールPBMCで見られる増殖の10～15%であることがわかります。これは平均して85～90%の増殖抑制に相当し、allo energized PBMCが第一者同種刺激因子に対して低反応性であることを示しています。この図に見られるように、一度習熟すれば、allo energizedドナー末梢血単核細胞へのバルク共培養は2～3時間でセットアップすることが可能です。

この手法は、病原体特異的免疫を維持しつつ、同種反応性を低減させたドナーT細胞を作製するために、臨床利用に向けた標準化が容易に可能です。このような細胞を同種造血幹細胞移植の際に養生的移植することで、過度な移植片対宿主病を伴わずに免疫再構築を改善させることができます。この手順を実施する際は、迅速に作業することが重要です。

これにより、細胞の生存能を維持し、非特異的な活性化や抗原提示細胞の喪失を避けることができます。刺激細胞または応答細胞に凍結保存されたPBMCを使用する場合は、生存細胞を安定して高率に回収できる、検証済みの凍結細胞蘇生プロトコルを使用してください。このビデオを視聴することで、ヒトドナー末梢血単核細胞のallo-anizationの方法と、この手順の有効性および特異性を評価するためのアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。この戦略は、同種反応を低減させたヒトドナーT細胞を生成するために利用でき、同種造血幹細胞移植後の免疫再構築を改善するための臨床応用が期待されます。