共刺激シグナル遮断によるアロ抗原刺激によるヒト末梢血単核球のアロ抗原特異的アネルギーの誘導

本実験の総合的な目的は、抗原提示細胞によるT細胞のCD 28受容体を介した共刺激をブロックする抗体の存在下で、レシピエントの同種抗原を用いてex vivo刺激を行い、レシピエント同種特異的ドナーT細胞を活性化させることです。これは、まず2名の異なる健康なドナーからPBMCを分離することで達成されます。次に、CD 28刺激をブロックするためにB 7.1およびB 7.2リガンドに対するモノクローナル抗質の存在下で、HLA不一致のPBMC集団をインキュベートし、バルクの同種活性化共培養系を構築します。

次に、アロ刺激の有効性を、一次および二次混合リンパ球反応（MLR）によって測定します。最後に、第三者およびCMV特異的な反応を測定することで、アロ刺激のアロ特異性を評価します。その結果、ドナーT細胞は、その後のアロ抗原刺激に対して低反応性になりますが、アロ反応性ではないドナーT細胞はそのまま機能的に維持されることが示されます。

我々は、HLA不一致幹細胞移植中および移植後の同種活性化ドナーT細胞の注入に関する、過去および現在進行中のパイロット臨床試験においてこの戦略を成功裏に採用し、未操作のHLA不一致移植レシピエントのヒストリカルコントロールと比較して、免疫再構築の改善、感染症の減少、および急性および慢性移植片対宿主病の重症化の軽減を確認しました。同種アノダイゼーション戦略の大きな利点は、この手法が病原体特異的または腫瘍関連抗原特異的なT細胞応答を低下させず、またドナーT細胞プールからCD4調節性T細胞を排除しないため、オフターゲット効果が最小限に抑えられることです。この手順を、当研究室のスタッフサイエンティストであるChristine Vinが実演します。最初のステップは、2人の健康なボランティアドナーから採血することです。

あるドナー由来の細胞をレスポンダーとし、別のドナー由来の細胞をスティミュレーターとして使用します。次に、Ficoll-Paqueを用いた密度勾配遠心分離法により、血液からPBMCを分離します。少量の細胞をトリパンブルーで染色し、ヘモサイトメーターを用いて生存PBMC数を計測します。

各ドナー由来のPBMCを、10 mLの完全培地を用いて、生存細胞濃度が1 × 10⁶ cells/mLとなるように個別の15 mLコニカルチューブに分注します。バルクアロエナジャイジング共培養を構築するため、ドナーPBMCのチューブの一方を刺激細胞として、もう一方を応答細胞として指定します。

刺激細胞用として指定した15 milliliterチューブに、anti B 7.1抗体およびanti B 7.2抗体をそれぞれ100 microgramsずつ加えます。チューブを穏やかに撹拌し、30 minutes間インキュベートします。インキュベーション後、刺激細胞用PBMCに放射線を照射し、ガス透過性キャップ付きのT 25 50 cubic centimeter細胞培養フラスコに分注します。

フラスコに「bulk allo coal culture」とラベルを貼ります。次に、完全培地を用いて1 million/mLに調整した別のドナー由来のレスポンダーPBMC 10 millilitersをフラスコに加えます。さらに、antib 7.1およびAntib 7.2抗体をそれぞれ100 microgramsずつフラスコに加え、静かに混合した後、フラスコを垂直に立ててインキュベーターに入れ、72時間培養します。

次に、ブロッキング抗体を用いないバルクコントロール共培養用として、別の1,000万個の刺激細胞PBMCを照射し、T 25 50 cubic centimeter 細胞培養フラスコに加えます。フラスコに「bulk control coal culture」とラベルを貼ります。バルク同種抗原刺激共培養に使用したものと同じレスポンダーPBMC 10 milliliters（完全培地中 1 million per milliliter）をフラスコに加え、静かに混ぜ合わせます。その後、フラスコを垂直に立てた状態でインキュベーターに入れ、72 hours 培養します。

次のステップは、バルク共培養のラベル付けと同日に、アロエナジャイズド・ドナーT細胞プールの機能を測定することです。測定予定の3つのタイムポイントそれぞれについて、底面U字型の96ウェルプレートに一次MLRを準備します。次に、バルクコントロールおよびアロエナジャイズド共培養からそれぞれ5 mLを分注し、15 mLチューブに入れます。

次に、各チューブから200 µLの細胞懸濁液を、3枚のプレートそれぞれの3連ウェルにピペッティングします。バルクコントロール冷所培養由来の細胞については、これらのウェルに「共刺激遮断なし」または「no CSB」とラベルを付け、バルク同種活性化冷所培養由来の細胞については「CSB」とラベルを付けます。その後、陰性対照として、各プレートの6つのウェルに200 µLの完全培地を加えます。

最後に、蒸発を抑制するために、すべての空のウェルに 200 µL の PBS を加え、バルク共培養のセットアップから 72 時間後にプレートをインキュベーターに入れます。測定予定の 3 つの時点それぞれについて、UBO 96ウェルプレートを「二次 MLR」としてラベル付けします。二次 MLR 用のレスポンダー細胞を準備するため、バルクコントロールおよびアロエナジャイジング共培養のそれぞれから 5 mL を 15 mL チューブに移し、室温で 2000 RPM で 5 ～ 10 分間遠心分離します。その後、上清を慎重に吸引してペレットを再懸濁し、各チューブに 10 mL の完全培地を加えて、さらに 2 回細胞を洗浄し、2 回目の洗浄後に再度細胞を遠心分離します。

完全培地 1 mL で細胞を再懸濁します。トリパンブルー染色を用いて生存細胞数を算出し、生存レスポンダー細胞の濃度が 1 million cells/mL となるように調整します。各チューブから細胞懸濁液 100 µL をピペットで取り、各プレートの 3 重ウェルに分注します。

これらのウェルに「first party」または「FP alloy stimulation」とラベルを貼ります。次に、各チューブから100 µLの細胞懸濁液を各プレートの別の3つのウェルにピペッティングし、これらのウェルに「CD 3/28 stimulation PBMC」とラベルを貼ります。これは、allo刺激用のfirst party刺激PBMCの供給に使用した同一ドナーからのものです。二次MLRの刺激細胞には、エネルギッシュおよびコントロール共培養を使用します。first partyドナーPBMC 10 millionを1 million/mLの濃度で懸濁し、照射して添加します。

各二次MLRプレートのfp allo restimulationとラベルされたウェルに、照射済みの刺激細胞を100 µLずつ加えます。陽性対照として、各二次MLRプレートのCD 3 28 stimulationとラベルされたウェルに、CD3およびCD28モノクローナル抗体をそれぞれ1 µLずつと、完全培地98 µLを加えます。さらに、陰性対照として各プレートの空のウェル6つに完全培地200 µLを加え、蒸発を抑えるためにすべての空のウェルにPBS 200 µLを加えます。

プレートをインキュベーターに入れます。次のステップでは、サードパーティドナーと呼ばれる新しい健康なドナーから分離したアロPBMCを用いて、二次MLRによりアロプロセスの特異性を測定します。サードパーティPBMCを1 million cells/mLの濃度で懸濁し、二次MLR特異性測定用の3枚の96ウェルプレートに分注し、3日目、5日目、7日目に照射ラベルを行います。

特異性を測定するための二次MLRに向けてレスポンダー細胞を調製するには、コントロール群およびアロエナジャイジング共培養群のバルクからそれぞれ5 mLを15 mLチューブに移し、2000 RPMで5〜10分間遠心分離します。次に、上清を慎重に吸引して除去し、ペレットを再懸濁させ、各チューブに10 mLの完全培地を加えて洗浄します。この洗浄工程を2回繰り返し、2回目の洗浄後、再度遠心分離を行います。最後に、細胞を1 mLの完全培地で再懸濁します。

トリパンブルー染色を用いて細胞数を計測し、生細胞のレスポンダー細胞濃度を1 million cells/mLに調整した後、各チューブから100 µLの細胞懸濁液を各プレートの3連ウェルにピペッティングします。これらのウェルに「TP」または「サードパーティ同種刺激（third party allo stimulation）」とラベルを付けます。次に、TP同種刺激とラベル付けしたウェルに、照射済みのTP刺激細胞を100 µL加えます。

病原体に対するアロ反応の特異性をさらに検証するため、あらかじめCMVに対する増殖反応が確認されているドナー由来のPBMCを活性化させた後、反応を測定します。ウェルプレートに「secondary M-L-R-C-M-V day three, five and seven」とラベルを付け、バルクコントロールおよびアロ活性化共培養系のそれぞれから5 mLを15 mLチューブに移します。次に、細胞を洗浄・計数し、完全培地を用いて1 million/mLの濃度で再懸濁します。各チューブから細胞懸濁液100 µLを各プレートの3つのウェルに分注し、これらのウェルに「CMV stimulation」とラベルを付けます。

次に、CMV刺激とラベル付けしたウェルに、完全培地 100 µL で希釈した CMV ライセート 0.1 µL を加えます。続いて、陰性対照として各プレートの 6 つのウェルに完全培地 200 µL を加えます。最後に、蒸発を抑えるため、すべての空のウェルに PBS 200 µL を加え、プレートをインキュベーターに入れ、一次および二次 MLR における増殖を測定します。

プレートの回収の16時間前に、陰性コントロールおよび細胞含有ウェルに1 µCiのトリチウム標識チミジンを添加する。TomTecハーベスターまたは同様の装置を用い、プレートごとに1枚のフィルターマットにチミジンを回収する。フィルターマットを1時間乾燥させる。

その後、それらを個別のサンプルバッグに入れます。それぞれに5 mLのシンチレーション液を加え、密封します。HLAミスマッチの刺激細胞および応答細胞のPBMCを用い、Wallachマイクロベータシンチレーションカウンターまたは同等品でフィルターマットを読み取り、実験の最後の16時間におけるトリチウムチミジンの取り込み量を測定します。

この図から、一次MLRにおいて共刺激遮断が存在すると、5日目のレスポンダーPBMCの平均アロ増殖が、共刺激遮断のない対照一次MLRで見られる値の約30%まで減少することがわかります。これは、5日目における一次アロ増殖の平均抑制率が約70%に相当することになります。この図に示されている通りです。

この図から、5日目における二次MLRでのアロ活性化PBMCの第一者アロ増殖は、通常、コントロールPBMCで見られる増殖の10～15%であることがわかります。これは平均増殖抑制率が85～90%に相当し、アロ活性化PBMCが第一者アロ刺激因子に対して低反応性であることを示しています。この図に示されているように、一度マスター化すれば、アロ活性化ドナー末梢血単核細胞へのバルク共培養は2～3時間で構築することが可能です。

この手法は、アロ反応性を低減させつつ病原体特異的な免疫能を維持したドナーT細胞を作製するために、臨床利用に向けて容易に標準化することが可能です。このような細胞を同種造血幹細胞移植において適応転移させることで、過度な移植片対宿主病を引き起こさずに免疫再構築を改善できます。本手順を行う際は、迅速に作業することが重要です。

これにより、細胞の生存能を維持し、非特異的な活性化や抗原提示細胞の消失を避けることができます。刺激細胞または応答細胞として凍結保存されたPBMCを使用する場合は、生存細胞を高率かつ安定して回収できる、検証済みの凍結細胞解凍プロトコルを使用してください。このビデオを視聴することで、ヒトドナーの末梢血単核細胞をアロ化する方法と、この手順の有効性と特異性を評価するためのアッセイ方法について十分な理解を得ることができます。この戦略は、アロ反応を低減させたヒトドナーT細胞を生成するために利用でき、同種造血幹細胞移植後の免疫再構築を改善するための臨床的な活用が期待されます。