Name: タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 学ぶ 卵胞カプセル化法。フィブリノゲン・アルギン酸溶液でマウス二次卵胞を包埋し、トロンビン・カルシウムで架橋。3D環境で細胞間相互作用を維持しながら卵胞成長と卵子成熟を支援する技術です。

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この作品は、NIH（U54HD41857とPL1EB008542、Oncofertilityコンソーシアムのロードマップ助成内P30バイオマテリアルコア）によって賄われていた。

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
<li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li>
<li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture%2C+in+vitro+follicle+development+and+transplantation%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li>
<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li>
<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+micro+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

FA - IPNの提示卵胞のカプセル化手法は 、in vitro での 3D環境での卵胞培養することができます。 FA - IPNは、初期の機械的性質がフィブリンとアルギン酸塩の両方の組み合わせによって決定される動的な、細胞応答行列です。培養中に、カプセル化された卵胞はもっぱら文化の終わりに残っているアルギン酸塩により提供され徐々に減少するゲルの剛性につながるIPNの一成分のみ、フィブリンを分解プロテアーゼを活性化する。 FA - IPNで得られた動的な機械的性質は、発展途上卵胞の自然環境と一致するように提案し、単独でアルギン酸と比較して卵母細胞減数分裂成熟の改良率に貢献している。 FA - IPNは、独立したメカニズムによって架橋システムの各コンポーネントで、マイルドかつ高速ゲル化を示しています。我々は、ゲル形成の速度はフィブリノーゲンとトロンビンの濃度によって制御できることを他の場所で5記載している。分解速度は、フィブリン分解のアプロチニン阻害することによって調整することができます。マウス二次卵胞は、通常より長い培養...

<table><tbody><tr><td>フェチュイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>Roche Group</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>rFSH</td><td>国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Tisseel フィブリンキット</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>アルギン酸ナトリウム</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>Mw 418kDa</td></tr></tbody></table>

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

卵胞は、性ホルモンを分泌する卵巣の機能単位であり、卵母細胞の成熟を ​​サポートしています。 試験管内卵胞の技術では基本的な生物学を調査するためにモデルの卵胞発育にツールを提供し、さらにで妊孕性を温存する技術として開発されているクリニック1-4。私たちの体外培養系では細胞間相互作用および傍分泌シグナリングその直接の卵胞発育5、3D濾胞アーキテクチャを維持することによって、ネイティブの卵巣の環境を模倣するために、ヒドロゲルを採用しています。以前に、卵胞が正常にアルギン酸塩、カルシウムイオン6月8日でゲル化を起こして不活性藻類由来の多糖類で培養した。 W / V 0.25％の濃度で形成されたアルギン酸ハイドロゲルは、卵胞の培養のための最も寛大であり、最も高い発生能9を保持。アルギン酸ハイドロゲルは、このように、卵胞の成長10を影響を与える可能性が卵胞に圧縮力で卵胞の直径の結果の増加分解性ではありません。私たちは、その後、フィブリンとアルギン酸の混合物を同時にゲル化されたフィブリンアルギン酸相互貫入ネットワーク（FA - IPN）、に基づいて、培養系を開発した。両方のコンポーネントが最初にマトリックスの剛性に寄与するので、この組み合わせは、動的な機械的な環境を提供しますが、成長する卵胞から分泌されるプロテアーゼは、サポートを提供する唯一のアルギン酸を残して行列にフィブリンを低下させる。 IPNと、アルギン酸の含有量は、アルギン酸5のみでは不可能である、0.25％未満に減少することができます。このように、卵胞が拡大するにつれて、それが減少固形分含有量のために少なく圧縮力が発生します。ここで、我々は、カプセル化方式とFA - IPN内の卵胞のためのin vitro培養系を説明します。動的な機械的な環境は、小さな卵胞が硬い皮質に存在し、彼らはサイズが11に増加するとより寛大髄質に移動する自然卵巣の環境を模倣しています。分解可能な成分は、人間の毛包は、通常は生体内で受けることが体積で10以上の6倍の増加をサポートするために、臨床翻訳のために特に重要になることがあります。

3Dフィブリン-アルギン酸相互貫入ネットワークにおける卵胞のカプセル化のための新しい方法が記載されている。このシステムは、成熟した卵母細胞を生成するために未熟な卵胞の発達をサポートするためにタンパク質分解と構造的な支持を兼ね備えています。このメソッドは、拡張を制限することなく、細胞間接触を維持するために培養細胞の集合体に適用してもよい。

卵胞は、性ホルモンを分泌し卵細胞の成熟をサポートする卵巣の機能単位である。in vitro（試験管内）卵胞培養技術は、...

本プロトコルでは、in vitro培養のための、フィブリン・アルギン酸相互侵入ネットワークを用いた卵胞の新しいカプセル化手法について記述します。二次卵胞は、中心に位置する卵母細胞と、それを囲む数層の体細胞で構成されており、これらの体細胞が卵母細胞の発達をサポートしています。三次元環境での卵胞のカプセル化および培養は、複数の細胞コンパートメント間のコミュニケーションを維持し、卵胞の球状構造を保持しながら、卵胞の拡大を可能にします。本プロトコルの最初のステップでは、ドロップ法を用いるために、生後16日目のマウス卵巣から二次卵胞を単離します。濾洗後、毛包をカプセル化溶液に移します。フィブリノゲン・アルギン酸溶液を用いて各毛包を吸引し、トロンビン・カルシウム溶液中にピペットで注入して、パラフォーム法でビーズを架橋させます。個々の毛包をパラフォームコートしたガラススライド上のフィブリノゲン・アルギン酸溶液の液滴に移し、トロンビン溶液を加えてF-A-I-P-N架橋を開始させます。次に、カプセル化された卵胞を成長培地に移し、FA IPN内でカプセル化された卵胞をイメージングします。このシステムは、未成熟卵胞が卵子を産生するための成長と発達を支援する構造的サポートと生物学的応答性を兼ね備えているため、細胞の拡張を制限することなく細胞間接点を保持させる細胞凝集体の培養に適用できる可能性があります。こんにちは、私はLonnie Sheaです。Three Wood Dripとの共同研究を通じて、卵巣卵胞のin vitro成熟のための培養システムを開発しました。この培養研究は、バイオエンジニアリングと生殖生物学の真の共同研究を反映したものです。本日は、実際にこの培養システムを開発した方々に、その手法を解説していただきます。まず、バイオマテリアルシステムを開発したバイオエンジニアリングの博士研究員、Ariel Checkoff氏です。次に、卵巣組織の取り扱い手順を開発した産婦人科学教室の生殖生物学者であるMinsuをご紹介します。彼らが共同で、卵巣組織の実際のカプセル化および培養方法について解説します。平坦なプラスチック表面での標準的な培養などの既存の手法に対する、本手法の主な利点は、フィブリン・アルギン酸システムが卵胞の三次元的な構造を維持しつつ、急速に拡大する卵胞に対して機械的に動的な環境を提供できることです。現在の装置における動的な機械的微小環境は、この技術をマウスモデルから潜在的な臨床応用に移行させる際にさらなる利点をもたらします。なぜなら、ヒトの卵胞が成熟し受精可能な卵子を産生し、最適な結果を得るためには、より広範な成長が必要だからです。pH制御のためL-15ベースの培地を使用し、温度制御のため37 °Cに加熱されたステージ上で、また細菌汚染を最小限に抑えるためにクリーンベンチ内で、すべての解剖操作を行ってください。新鮮に解剖した卵巣を、0.1% collagenaseおよび0.1% DNAseを含む維持培地1〜2 mLを入れた新しい35 mmペトリ皿に移し、二酸化炭素インキュベーターで15分間インキュベートします。コラゲナーゼを除去するためにサンプルをDMで洗浄し、卵巣から卵胞を分離するため、新鮮なDMが入った35 mmペトリ皿に移します。インスリン用注射器に取り付けた28Gまたは8Gの針を用いて、卵巣全体から卵胞をそっと弾き飛ばすようにして分離します。卵胞の完全性を損なわないように注意しながら、可能な限り多くのストローマ細胞を取り除いてください。卵巣1個につき、直径130〜150 µmの二次卵胞を20〜40個摘出します。これらの卵胞は通常、2〜3層の顆粒膜細胞を有しています。次に、IVF用ディッシュの中央ウェルにmmを1 mL、外周リングにmmを3 mL加えます。ピペットを用いて、損傷のない卵胞をIVFディッシュの外周リングに移動させます。このIVFディッシュを、37 °C、5% carbon dioxide のインキュベーター内に保持します。すべての卵胞の回収が完了した後、5～8倍の倍率の解剖顕微鏡下でサンプルを観察し、2～3層の顆粒膜細胞層があり、卵母細胞と顆粒膜細胞の間に隙間がなく、卵母細胞が円形で完全な形態を呈している、サイズ130～150 µmの健全な卵胞を選択します。健全な卵胞を、カプセル化のために別のIVFディッシュの中央へ転移させます。ドロップ法による卵胞のカプセル化では、IVFディッシュの中央ウェルに50 IU/mLのトロンビン溶液を1 mL加えます。フィブリノゲンストック溶液を融解し、氷上で保持してください。そして、カプセル化の直前にフィブリノゲンを室温に戻します。使用の直前に、1×PBS 0.5% アルギン酸溶液と 50 mg/mL のフィブリノゲンを混合して、フィブリノゲン・アルギン酸溶液を調製します。1.7 mLの滅菌マイクロ遠心チューブに、フィブリノゲンを2:1:1の比率で加えます。軽くボルテックスし、わずかに白濁した溶液を遠心分離して蒸発を抑えます。解剖顕微鏡のヒーティングステージの電源を切り、IVFディッシュの外周リングのコーナーに配置します。カプセル化用に90 µLのフィブリノゲンアルギネート溶液を、洗浄ステップ用に10 µLの液滴を準備します。10〜15個の卵胞を、最小限の培養液とともに10 µLの液滴に転移させ、少量の溶液ですり混ぜた後、すべての卵胞を90 µLの液滴に転移させて混合します。10 µLチップを用いて、5 µLのフィブリノゲンアルギネート溶液とともに卵胞1個を吸引し、IVFディッシュ中央のトロンビン溶液中に卵胞とフィブリノゲンアルギネート溶液を放出します。すべての卵胞がカプセル化されるまで、この操作を繰り返します。ビーズをトロンビンカルシウム溶液中で5〜7分間静置し、ゲルの架橋を行います。フィブリンが形成されるにつれて、ビーズの色が濃くなります。色の濃いビーズから順に、維持培地へ移します。まず、37 °Cで15〜30分間インキュベートし、残りのトロンビンを洗い流します。最後に、ビーズを培養プレートに移してイメージングを行います。直ちに、0.5% alginateと50 mg/mLのフィブリノゲンを混合して、フィブリノゲンアルギン酸溶液を調製します。1.7 mLの滅菌マイクロ遠心チューブ内でフィブリノゲンを1:1の比率で調製し、フィブリノゲン・アルギン酸混合液を7.5 µLずつパラフィンコートガラス上に滴下します。3 mmのスペーサーを用いてスライドさせ、少量の培地とともに、各滴に1つの卵胞を移します。ゲルがほぼ瞬時に形成されるため、卵胞に触れたり混ぜたりしないように注意しながら、各ドロップに7.5 µLのトロンビン溶液を加えます。パラフィルムを貼った2枚目のガラスでゲルを覆います。スライドを100 mmディッシュに入れ、インキュベーター内で5分間倒立状態で静置します。必要に応じてピンセットを用いて、粘着性ビーズを維持培地へ、次いで2日ごとに培養ウェルへと移します。光学顕微鏡を用いて培養卵胞を撮影し、Image Jを用いて卵胞径を測定します。また、2日ごとに成長培地の半分を新鮮な平衡化成長培地と交換します。8日間の培養後、フィブリン成分が完全に分解されるためハイドロゲルは透明になり、卵胞は直径400 µm以上の最終サイズに達します。成長培地を除去し、10 IU/mLの溶液を100 µL加えます。アルギン酸を分解するため、α-MEMにアルギネートリアーゼを加えます。プレートをインキュベーターに25～30分間置きます。その後、鈍端チップを用いて、部分的に溶解したビーズから卵胞を取り出します。卵胞を解剖用培地が入ったIVFディッシュの外輪に移してアルギン酸結合物を洗浄し、その後、内輪に移します。次に、HCGとEGFを含む成熟培地を用いて、胞状卵胞をIVFディッシュの外輪、次いで内輪へと移し、二酸化炭素インキュベーターで15〜16時間培養します。培養物を観察し、卵丘細胞の拡張を確認して卵丘細胞を除去します。IDE溶液を最終濃度 0.1 mg/mL となるように加え、37 °C、5% CO2 下で2〜3分間インキュベートします。マウスピペットを用いて卵母細胞を卵丘細胞から分離し、最後に顕微鏡下で成熟段階を判定します。アルギネートは、メッシュサイズ、制御可能な剛性、生物学的不活性などの生化学的特性や、穏やかな性質を持つため、in vitroでの卵胞培養に適した天然バイオマテリアルです。カプセル化された小さな卵胞は、培養初期にはアルギネート内で低い圧縮力を受けます。しかし、卵胞が拡大するにつれて、ビーズ内の置換体積が増加し、その結果、卵胞の拡大方向とは逆方向に、より大きな圧縮力が生じます。架橋前、フィブリリン・アルギン酸溶液中では個々のポリマー鎖が完全に絡み合っています。F-A-I-P-Nの両成分は、トロンビンとカルシウムの混合物に曝露されるとすぐに架橋し始めます。培養期間中に濾胞がF-A-I-P-Nのフィブリン成分を分解しますが、これは濾胞の周囲に現れる透明な円によって示されます。濾胞の3D構造は、残存したアルギン酸によって支持されています。これらの画像は、F-A-I-P-Nにおける第2次卵胞の0日目、4日目、6日目、およびその結果生じたM2期Xの経過を示しています。極体とともに、アプロチニンはフィブリンの分解を遅らせるために培地に添加できるプロテアーゼ阻害剤です。最初の4日間に0.01 TIU/mLのアプロチニンを培地に添加すると、卵胞はマトリックスを分解できなくなります。そして、アプロチニンを除去すると、卵胞は成長を再開し、胞状期に達します。しかしながら、当初高濃度のアプリトニンで培養した濾胞では、成長が抑制されました。本研究では、三次元フィブリン・アルギン酸ネットワークを用いて、濾胞の封入状態を変化させながらin vitroで培養する新しい手法を実証しました。このシステムは、培養期間を通じて濾胞構造を健全に維持するだけでなく、in vitroでの濾胞形成を成功させ、その結果、M 2段階のOサイトを導き出します。この技術は、卵胞がどのように機能するかを解明する上で重要であり、より一般的に、若年の癌患者に不妊治療の選択肢を提供する可能性があります。この培養システムは、細胞クラスターの培養や、細胞が構造を形成しながら組織化していく過程の培養に使用できます。これらの3D培養システムは、組織の成長を分子レベルで解析するための貴重なツールとなるでしょう。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

それらの三次元コンテキストで正常な細胞の培養は、細胞の形質転換および腫瘍形成に必要な初期の事象を研究するための代替メソッドを表します。このメソッドは、卵巣癌の形成の初期イベントを研究するために、通常の卵巣と卵管の細胞を成長させるために使用されます。...

卵巣と卵管の三次元器官培養用アルギン酸ゲル

このビデオでは、ブタの卵丘-卵母細胞複合体(COC)をフィブリン-アルギン酸ビーズにカプセル化して3D培養を確立するためのプロトコルについて説明しています。このin-vitro成熟システムは、正常な細胞間コミュニケーションを維持し、卵子の成熟と生存率の維持を保証します。...

ブタCOCの3D培養:フィブリン‐アルギン酸ポリマーヒドロゲルビーズにCumulus Oocyte complexesをカプセル化する手順

このビデオでは、ブタの卵子を疎水性マイクロバイオリアクターにカプセル化するためのプロトコルについて説明します。...

Liquid Marble Microbioreactor System:ブタ卵母細胞のカプセル化のための3D培養プロトコール

このプロトコルは、新生児マウスと思春期前のマウスからの個々の卵胞から卵巣を使って、マウスの卵巣組織の初代培養/共培養を説明しています。培養技術は、卵巣上の外因性薬剤の効果の研究を可能にする、高度に生理的な方法で開発を支援し、卵胞の間の相互作用の。...

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

ここでは、3D培養条件でのブタ卵母細胞のカプセル化のための2つのプロトコルを示します。第1に、cumulus-oocyte複合体(COC)はフィブリンアルギン酸ビーズにカプセル化される。第2に、フッ素化エチレンプロピレン粉末粒子(マイクロバイオリアクター)で封入される。両システムは、3D組織を維持するために最適な条件を保証します。...

ポルシン卵母細胞カプセル化のためのタンパク質分解アルギン酸ヒドロゲルおよび疎水性マイクロバイオリアクター

このプロトコールは、チラミン結合ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いてマウス卵巣から前胞状卵胞をカプセル化し、培養するための新しい3次元(3D)培養モデルについて述べています。また、ガラス化による卵巣卵胞凍結保存への2つのアプローチについても詳しく説明します。...

新規ヒアルロン酸ハイドロゲルの三次元卵胞培養への応用とマウス卵巣卵胞凍結保存の方法論

in vitro の配偶子形成を補完する新しい足場を含まないアガロースカビで卵胞を培養する方法について説明します。...

足場のないマウス卵胞培養のためのカスタマイズ可能なアガロースモールドの製造と使用

私たちは、卵巣の間質豊富な部分からマウス卵巣体細胞を単離する方法と、足場を使わない方法でマウス卵巣体細胞オルガノイドを生成する方法を述べます。...

卵巣微小環境の探査:マウス卵巣体細胞の単離、2次元培養、オルガノイド培養の方法

メソッドは、I型コラーゲンと初代ヒト線維芽細胞からなる3次元マトリックスの調製について記載されています。この器官ゲルは、それが組織の間質の基本的な機能を模倣し、顕微鏡の多くの形態が可能であるため、侵襲的な細胞遊走を評価するために有用な基質として機能します。...

器官型コラーゲンIアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム

金の長鎖アルカンチオールから形成された自己組織化単分子層（SAM）は、蛋白質のパターンとセルの閉じ込めを形成するための明確に定義された基質を提供しています。ポリジメチルシロキサン（PDMS）グリコール終端アルカンチオールの単量体との埋め戻しに続いてスタンプを使用してhexadecanethiolのマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質や細胞の吸着のみスタンプhexadecanethiol地域にパターンを生成します。...

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

学ぶ 卵胞カプセル化法。フィブリノゲン・アルギン酸溶液でマウス二次卵胞を包埋し、トロンビン・カルシウムで架橋。3D環境で細胞間相互作用を維持しながら卵胞成長と卵子成熟を支援する技術です。

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

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