固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）

この手順では、シーエレガンスの標準的なアベースプレートに食事制限を行い、寿命、繁殖、代謝への影響を研究します。これは、まず、食料源として使用される細菌の濃度を正確に測定することによって達成されます。手順の2番目のステップは、細菌培養物を適切な濃度に適切に希釈することです。

次に、死滅した細菌を含むベースSDRプレートを準備します。最後に、年齢同期した線虫の集団でSDR実験を設定します。子孫生産と寿命の測定結果は、子孫生産の遅延と減少、および平均寿命の増加を示すことがあります。

AZA媒体のDianのような60の方法上のこの技術の主な利点は、すべての実験が食事制限実験のためのほとんどの暖かい実験室で使用される標準的な固体AGAベースの遊びで行われることであり、優雅さは、食品源として使用される各細菌株のための別々の検量線を確立するを参照してください。lb寒天培地の新鮮なストリークから大腸菌OP 50細菌の単一のコロニーを選び、3ミリリットルの液体lbブロス培養物を摂氏37度のシェーカーで一晩接種します。一晩培養の連続2倍希釈液を調製します。

次に、600ナノメートルでの各希釈液の吸光度を分光光度計で3回測定します。さらに、各細菌懸濁液を100万倍にして、100万倍に希釈した各希釈液の0.4ミリリットルを100mmポンドのアグリプレートに播種し、摂氏37度で18〜24時間インキュベートします。各プレートで成長した細菌コロニーの数を数え、各サンプルのミリリットルあたりのコロニー形成単位を計算します。

次に、OD 600を細菌濃度の関数としてプロットし、線形回帰分析を実行して、測定されたOD 600値とOP 50細菌濃度の関係を確立します。この方法では、アドリド摂食条件では10〜11CFUs/mLの1倍、DR供給条件として1mLあたり10〜8CFUの1倍の細菌濃度を用いる。ただし、完全な用量依存関係を確立するには、4〜6つの異なる細菌濃度が必要になる場合があります。

SDRとその対応について。3ミリリットルの液体LBブロスに大腸菌OP 50細菌の単一コロニーを含む接種物を調製し、摂氏37度のシェーカーで6〜8時間培養します。OP 50 培養液を 500 ミリリットルの LB ブロスが入った新しいフラスコに移し、必要に応じてバクテリアが飽和するまで一晩成長させます。

OD 600での吸光度を測定するために、OP 50培養物の適切な希釈液を調製します。細菌濃度を測定するには、1500 Gで20分間遠心分離することにより、細菌をペレット化します。上清を取り除き、バクテリアを1ミリリットルあたり12番目のCFUの10の1倍の濃度に再懸濁します。.

次に、10ミリリットルの細菌培養物を、12分の10の1倍から7分の10の10倍までの6つの異なる濃度で調製します。2ミリリットルのバクテリア培養物を60ミリメートルの固化したN GMプレートの中心に向けます。表面の傷がワームが曝気液に穴を掘ることを可能にするため、ピペットチップでプレートの表面に触れないでください。

プレートを摂氏37度のインキュベーターに1時間置きます。次に、100ミリグラム/ミリリットルの炭酸飲料と10マイクロリットル/ミリリットルあたり50ミリグラムの10マイクロリットルを各プレートに適用して、バクテリアの残りの成長を促します。異なる濃度の抗生物質で死滅させた細菌を摂氏4度で保存し、最大1か月間使用してください。

十分なプレート、できればプラント全体で同じバッチを準備して保管することが重要です。少なくとも1〜2日前に実験して、細菌の生存率を確認してください。SDRプレートからいくつかのバクテリアをこすり落とし、炭酸、セイン、アンチマイシンを入れた空のN GMプレートに広げます。

プレートを摂氏37度のインキュベーターに6〜8時間置き、細菌の増殖がないことを確認します。寿命分析や子孫生産プロファイリングなど、SDR関連のほとんどの研究では、年齢同期した線虫の集団の準備が不可欠です。プラチナウォームピッカーを使用して、20〜30人の生殖活動活性成体をいくつかの通常のNGMプレートに移します。

OP50付き。実験に必要な卵子の数によっては、より多くの成虫が必要になる場合があります。プレートを摂氏20度に4時間放置して、産卵を許可します。

成虫をプレートから取り出し、プレートに卵がないか目視検査します。プレートを摂氏20度でインキュベートし続けて、子孫がL後期の4日目の1つの成体期に成長できるようにします。通常、これは摂氏20度のN個の2つの野生型ワームの場合、3日かかります。

寿命解析用。10〜12日目の成虫をSDRプレートに移して、食事制限を開始します。十分な統計検出力を得るには、SDR 条件ごとに合計 60 から 100 のワームを使用します。

すべてのワームが死ぬまで、2〜3日ごとに各ワームの生存率をスコアリングします。重要なのは、飢餓を避けるために、ワームを隔日で新しいSDRプレートに移すことです。この検量線は、OP 50 濃度を OD 600 と比較してプロットしています。

線形回帰分析によって生成された方程式は、OP 50細菌濃度の将来のすべての計算に使用できます。この研究では、野生型寄生虫のSDRに対する通常の用量依存的な反応と比較して、さまざまな線虫株の平均寿命に対する慢性SDR治療の効果を分析します。SDRの寿命効果はDR2の過剰発現によって部分的に抑制されますが、DAF 16 MU 86変異はSDRによる寿命延長に影響を与えません。

このビデオを見た後、海の優雅さで標準的なAGAベースの遊びでDianを実行する方法をよく理解しているはずです。