Name: 固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans） /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学ぶ固体プレートベースの食餌制限法をCaenorhabditis elegansで。殺菌した細菌を用いて寿命と繁殖に及ぼす影響を評価し、老化と代謝のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は、A. - LHへネイサンショックセンター（P30 AG13283）と国立老化研究所（NIA）からR01助成金（R01 AG028516）からのパイロット賞によってサポートされていました

1。細菌の濃度を推定するための検量線の確立このセクションでは、C言語の食事制限の実験のための食料源として使用される任意の細菌株（例えば、OP50、HT115）のための細菌の濃度を推定する方法を説明しますエレガンス 。別々の検量線は、株が使用されている各細菌のために確立されるべきである。 <ol><li> E.のシングルコロニーを植菌大腸菌 OP50細菌は、3 mLの液体LBブロス中のLB寒天培地上の細菌の新鮮な筋から選んだ。 </li><li>場所OP50 37文化℃のシェーカーと細菌が一晩増殖することができます。 </li><li>一晩培養液からの細菌懸濁液（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍速）の連続2倍希釈液を調製する。 </li><li>三重での分光光度計により600 nmで、各希釈液の吸光度（光学密度）を測定します。 </li><li>さらにそれぞれの細菌懸濁液100万倍（1000倍希釈倍）希釈する。 </li><li> 100mmのLB寒天プレート上に均等に各希釈液の細菌懸濁液0.4 mLを広げる。 </li><li> 18〜24時間、37℃インキュベーターでOP50のある場所LBプレートを。 </li><li>各プレート上で生育した細菌のコロニーの数を数えます。コロニー数は、各サンプルに対してmL当たりのcfu（コロニー形成単位）の計算に使用されます。 </li><li>測定OD 600の値とOP50細菌濃度との関係は、細菌濃度（CFU / mL）をの関数としてOD 600をプロットし、線形回帰分析（図1）を実行することによって確立することができます。 </li></ol>ソリューション： <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2">ルリアブロス（LB）、1L： </td></tr><tr><td> 10グラム</td><td>バクトトリプトン</td></tr><tr><td> 5グラム</td><td>酵母エキス</td></tr><tr><td> 10グラム</td><td> NaClの</td></tr></tbody></table> 1Lに脱イオン水を追加。 オートクレーブ、室温で保管。 2。固体プレートベースの食事制限（SDR）プレートの調製このセクションでは、固体プレートベースの食事制限（SDR）の実験で使用するためのプレートの準備について説明します。通常は、我々は、条件と1この方法のための最適なDRの給餌条件として× 10 8 CFU / mLの送りを自由に摂取として1 × 10 11 CFU / mLの細菌の濃度を考慮してください。しかし、4-6異なる細菌の濃度は、SDRとその応答のための完全な用量依存関係を確立するために必要な場合があります。 <ol><li> E.のシングルコロニーを植菌3 mLの液体LBブロス中の大腸菌 OP50細菌。 </li><li> 37℃のシェーカーでOP50文化を置き、細菌が6〜8時間のために成長することができます。 </li><li> 500mLのLBブロスを含む新しいフラスコにOP50文化を転送し、℃でシェーカー一晩37に戻ってOP50文化を置きます。 </li><li>細菌濃度（濃度は第1部で生成された検量線を用いて計算される）を決定するOP50文化のOD 600を測定する。適切な希釈液は吸光度の正確な測定のために必要になる場合があります。 </li><li> 20分1,500 gで遠心分離によってペレットOP50細菌。 </li><li> 1 × 10 12 CFU / mLの濃度にバクテリアを再懸濁します。 </li><li> 6つの異なる濃度で10 mLの細菌の培養を準備：1 × 10 12、10 11、10 10、10 9、10 8、10 7 CFU / mLの。 </li><li> 60mmの中央に細菌の培養のピペット0.2mLのは、NGMプレートを固めた。表面に打痕が寒天プレートに穴にワームを許可するように、ピペットチップとプレートの表面に触れないようにしてください。 </li><li> 1時間37℃のインキュベータ内の場所のプレート。 </li><li>細菌の増殖を阻止するために、各プレートに100mg/mLカルベニシリン及び50mg/mLのカナマイシン10μLの10μLを適用します。 </li><li> 4の抗生物質 - 死菌の異なる濃度° C今後の使用のために（最大1ヶ月）。と店舗プレート少なくとも1〜2日後に控えて全体の計画的な実験のための十分なプレートを準備して格納することが重要です。全体の実験のための板の同じバッチを使用することが望ましい。 </li><li>細菌の生存性を確認するには、SDRのプレートのいくつかの細菌をこすり取ってカルベニシリンおよびカナマイシンによる空のNGMプレート上に広げる。 6-8時間、37℃のインキュベーターでプレートを配置し、細菌の増殖（ない細菌の増殖が観察されないはず）を確認してください。 </li></ol>ソリューション<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2">線虫の増殖培地（NGM）、1L： </td></tr><tr><td> 3グラム</td><td> NaClの</td></tr><tr><td> 2.5グラム</td><td>バクトペプトン</td></tr><tr><td> 20グラム</td><td>寒天</td></tr></tbody></table>ove_contentは"&gt; 40分間オートクレーブし、65に冷却させ° C、その後に追加： <table border="1"><tbody><tr><td> 1 mLの</td><td> 1 M MgSO 4を </td></tr><tr><td> 1 mLの</td><td> 1 M CaCl 2を </td></tr><tr><td> 1 mLの</td><td> 5 mg / mLのコレステロール</td></tr><tr><td> 25 mLの</td><td> 1Mリン酸カリウム、pH6.0の</td></tr></tbody></table>すぐに10mLのアリコートで60ミリメートル× 15ミリメートルのペトリ皿に水などの液体NGMを注ぐ 3。 SDRの実験のセットアップこのような寿命の解析と出生率のプロファイリングとして、SDRに関連する研究、のほとんどは、ワームの年齢同期人口の準備が不可欠です。他の研究では、単に食事制限を開始するために、SDRの板に定期的なOP50プレートからワームを転送する。このセクションでは、SDRの動物のために寿命の解析を設定するプロトコルを例として説明されています。 <ol><li> OP50でいくつかの定期的なNGMプレート上に20〜30生殖アクティブな大人を転送するためにプラチナのワームピッカーを使用してください。実験に必要な卵の数に応じて、より多くの大人が必要になることがあります。 </li><li> 20℃でプレートを残す℃で4時間は、産卵を可能にする。 </li><li>プレートから成人を取り外します。プレートを視覚的に卵のために点検してください。 </li><li> 20℃でプレートを残し° Cと子孫がLate-L4/day大人1名のステージに発展することができます。通常、これは20℃N2野生型のワームのために3日かかる℃に</li><li>食事制限を開始するSDRのプレートに1日成人の適切な数を転送する。 </li><li>寿命の分析については、各SDR条件のプレート当たり10から20までのワームで6〜8枚の合計を設定します。 </li><li>すべてのワームが死亡するまで2日ごとにそれぞれのワームの実行可能性を得点する。それは、ワームは、食品の完全な剥奪を避けるために、すべての12から48時間新鮮なSDRの板に転送することが重要です。 </li></ol> 4。代表的な結果： 図1に示すようにOD 600との関係でOP50濃度の推定のための代表的な検量線のプロットである。ライナーの回帰分析によって生成された方程式は、OP50細菌濃度の将来のすべての計算に使用することができます。図2に示すように、別のワームの株の平均寿命に慢性SDRの治療の効果を測定することの例です。青いラインは、SDRに野生型ワームの通常の用量依存性の応答を表します。 DAF - 16（mu86）は SDR -誘導寿命の延長には何の影響もないまま、赤いラインは、SDRの寿命の効果が部分的にDRR - 2 OEによって抑制されていることを示します。 Cで寿命の解析を行うための詳細の方法虫は 1-3以前の文献に記載されている。 <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 E.の推定のための検量線の代表結果大腸菌 OP50濃度。 OP50濃度は、測定OD 600値の関数としてプロットされます。エラーバー= SD泊細菌の培養は、cfuの測定前に1,000 ×倍の吸光度測定の前に8倍、16倍、32倍、1.5倍2倍、4倍希釈し、そしてさらに希釈した。 <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：C.の代表結果虫の寿命実験では、SDRへの応答の異なる2つの変異体（緑と赤）（チンらから図4）と野生型のN2の動物（青）を比較。エラーバーは= SEM

<ol><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li>
<li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li>
<li>Weindruch, R., Walford, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeindruch%2C+R+%22The+Retardation+of+Aging+and+Disease+by+Dietary+Restriction%22">The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction</a>. , Thomas. (1988).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield+history%3A+caloric+restriction%2C+slowing+aging%2C+and+extending+life%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+caloric+restriction+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Overview of caloric restriction and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).</li>
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<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li>
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<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li>
<li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li>
<li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

食事制限（DR）が寿命を増やすおよび5-7哺乳類を含む種の広い範囲で様々な加齢に伴う病気の発症を遅らせることが知られている。両方の環境と遺伝子操作は、CのモデルDRに使用されている半定義された液体培地8,9、液体培地10-12で細菌の食物源の希釈、およびより遅い速度13で送り、その動作の変異体の使用で培養型ワームなど、 エレガンス、。液体培地で培養するワームはほとんどのワームの研究室で適合した固体培地プレートの条件とは異なる成長条件を伴うのに対し、しかし、DRの遺伝的模倣は、DRに関係のない表現型を生成することがあります。標準的な固体プレート上で実行されたDRのプロトコルが有用になるため、4,14,15、いくつかのグループによって開発されました。 ここで記述されたプロトコルでは、細菌は食物摂取のレベルを制御する方法として、プレートに二つの異なる抗生物質を適用することによって殺される。しかし、このようなUVの暴露のような代替方法は、細菌の増...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td> Duchefa Biochemie </td><td> C0109.25 </td><td>水に溶解。 </td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>ロッシュ</td><td> 10106801001 </td><td>水に溶解。 </td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>ベクトンディッキンソン社</td><td> DF0118072 </td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>ベクトンディッキンソン社</td><td> DF0123075 </td><td></td></tr><tr><td>バクト酵母エキス</td><td>ベクトンディッキンソン社</td><td> DF0127071 </td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>ベクトンディッキンソン社</td><td> DF00145170 </td><td></td></tr><tr><td>無菌培養管</td><td>米国サイエンティフィック</td><td> 1485-0810 </td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>アマシャムバイオサイエンス</td><td>遺伝子クワントプロ</td><td>アマシャムは現在GEヘルスケアの一部です。 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>ベックマンコールター</td><td> Accuspin FR </td><td></td></tr></tbody></table>

固体プレートベースの食餌制限線虫（caenorhabditis elegans）</em

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

栄養失調や飢餓のない食物摂取の減少は、寿命を向上させ、哺乳動物を含めた種の広い範囲で様々な加齢に伴う病気の発症を遅らせることが知られている。また、体重と生殖能力の低下だけでなく、血漿グルコース、インスリン、およびこれらの動物におけるIGF - 1の低いレベルになります。この治療はしばしば、食事制限（DR）やカロリー制限（CR）と呼ばれています。線虫Caenorhabditis elegansは老化の生物学を研究するための重要なモデル生物として注目されています。環境と遺伝子操作モデルDRに使用されてきたとCで寿命を延ばすことが示されている両方エレガンス 。しかし、C言語で報告されたDRの研究の多くエレガンスは、加齢分野における遺伝学的研究のほとんどはペトリ皿の標準固形寒天上で行われた一方、液体培地で動物を伝播することによって行われた。ここでは、死菌と標準固体NGM寒天ベースのプレートを使用してDRのプロトコルを提示する。

ここでは、固体プレートベースの食事制限を行うためのプロトコルを提示<em&gt; C.エレガンス</em&gt;死菌で。

固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）</em

栄養不良や飢餓を伴わない食事摂取量の制限は、寿命を延ばし、広範な加齢に伴う様々な疾患の発症を遅らせることが知られています。

本手順では、寿命、生殖、および代謝への影響を調べるため、海塩培地を用いた標準的なアガロースプレート上で食事制限を行います。まず、餌として使用する細菌の濃度を正確に測定します。次に、細菌培養液を適切な濃度まで適切に希釈します。次に、死滅させた細菌を含むベースSDRプレートを調製します。最後に、齢同期させた線虫集団を用いてSDR実験を行います。産卵数および寿命の測定結果から、産卵の遅延と減少、ならびに平均寿命の延長が示されます。AZA培地を用いたDianなどの手法と比較して、本手法の主な利点は、多くの研究室で食事制限実験に使用されている標準的なAGAベースの固形プレート上で全ての実験が行えることです。餌として使用する各細菌株について、個別の検量線を設定してください。LBアガー上の新鮮なストリークからE. coli OP50細菌の単一コロニーをピックアップし、3 mLの液体LBブロス培地に接種し、37 °Cのシェーカーで一晩培養します。この一晩培養した培養液の2倍連続希釈系列を調製します。次に、分光光度計を用いて、各希釈液の600 nanometersにおける吸光度を3連で測定します。さらに、各細菌懸濁液を100万倍に希釈し、各希釈段階の細菌懸濁液0.4 millilitersを100 millimeter lb agriプレートに均等に播種し、37 degrees Celsiusで18 to 24 hours培養します。各プレートに形成された細菌コロニー数を計測し、各サンプルの1milliliterあたりのコロニー形成単位（CFU）を算出します。次に、細菌濃度に対するOD 600をプロットし、線形回帰分析を行って、測定されたOD 600値とOP 50細菌濃度の関係を明らかにします。本手法では、ad libitum給餌条件には1×10¹¹ CFU/mLの細菌濃度を、最適なDR給餌条件には1×10⁸ CFU/mLを使用します。ただし、完全な用量依存的な関係を確立するためには、4〜6種類の異なる細菌濃度が必要になる場合があります。SDRおよびその応答のため、e coli OP 50細菌の単一コロニーを用いて、3 mLの液体LB培地で接種液を調製し、37 °Cのシェーカーで6〜8時間培養します。必要に応じて、OP 50培養液を500 mLのLB培地を含む新しいフラスコに移し、細菌が飽和状態に達するまで一晩培養します。OD 600で吸光度を測定するため、OP 50培養液の適切な希釈液を調製します。細菌濃度を決定するには、1500 Gsで20分間遠心分離して細菌をペレット化します。上清を除去し、細菌を1×10¹² CFUs/mLの濃度で再懸濁します。次に、1 mLあたり1×10¹²から1×10⁷ CFUの範囲で、6つの異なる濃度の細菌培養液を10 mLずつ調製します。60

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線虫を維持し、伝播の容易さ...

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

の&lt;em&gt;線虫のエレガンは&lt;/ em&gt;は、開発と生理学で多価不飽和脂肪酸の機能を探求するための有用なモデルである。このプロトコルは、の&lt;em&gt; Cを補充する効率的な方法を説明します虫&lt;/ em&gt;の多価不飽和脂肪酸とダイエット。...

多価不飽和脂肪酸の食事補給<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

このプロトコルは、画像に線虫（Caenorhabditis elegans）の胚における組織内の細胞を分割する方法について説明します。いくつかのプロトコルは、初期胚の画像細胞分裂に、このプロトコルはどのように中期後期胚形成の間に開発し、組織内の細胞分裂像に説明して方法について説明している。...

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em&gt; C.虫</em&gt;胚

ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;栄養状態ベースの銅回避アッセイ

ここでは、遺伝子発現および寿命に関連して広範な範囲の食餌療法の制限するためのフレームワークを提案する.広い範囲の食餌療法の制限のため、このパラダイムの下での遺伝子発現の定量的影像化のためのプロトコルについて述べる。我々...

線虫の遺伝子発現レベルの間に寿命変調下広い範囲食事制限によってエンコードされた情報の定量化

このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合タンパク質マーカーとして、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) による熱ストレス蛋白質の核移行を追跡する方法を示しますを汚します。プロトコルを汚す DAPI は速く、GFP...

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

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細菌クリアランスの測定による 線虫 の食物摂取量の定量化

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固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）

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