細胞星状に7つのステップ

この手順の全体的な目的は、マウス肝臓から肝星細胞を単離することです。まず、消化酵素を用いてマウス肝臓に2回の灌流を行います。灌流後、肝臓を細かく裁断して、次に行うin vitro消化の効率を高めます。

最終ステップとして、密度勾配遠心分離により、肝星細胞を他の肝細胞型から分離します。最終的に肝星細胞が得られ、その純度は光学顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡によって評価できます。本手順を実演するのは、研究室の大学院生であるPatrick Meyerです。マウス肝臓のNC 2灌流の準備として、まずSC 1バッファーと酵素灌流溶液を37 °Cの恒温槽で温めておきます。

次に、ペリスタルティックポンプを6.5 milliliters per minuteの層流が得られるように設定し、ポンプのシリコンチューブをSC one溶液で平衡化します。続いて、反射の消失を確認し、麻酔したマウスが深く鎮静されていることを確かめます。その後、マウスを適切なベースの上に仰臥位で固定します。

ハサミとピンセットを使用して腹壁を縦方向に切開し、腹膜を露出させます。腹膜を慎重に開き、腸管を腹腔から動物の左側に移動させて、門脈を露出させます。この手順で最も困難なのは、消化酵素を用いた肝臓のゼト灌流であり、これについて実演します。

次に、カニューレを挿入する際は実体顕微鏡を使用し、灌流中の肝構造の変化を注意深く観察することが重要です。実体顕微鏡下で、注入セットのカニューレを門脈に挿入します。30 millilitersのSC one溶液で肝臓の灌流を開始してください。血流の開始直後に下大静脈を切開します。

肝臓の洗浄が成功したことは、肝組織の色が抜けることで確認できます。次に、30 millilitersのPronase E溶液で肝臓を灌流します。Pronase E溶液による灌流後、肝葉は膨張し、被膜を通して肝小葉が明瞭に観察されるようになります。続いて、30 millilitersのcollagenase P溶液で灌流します。collagenase Pによる灌流が完了したら、横隔膜および周囲の臓器から慎重に剥離してマウスから肝臓を採取し、氷上の70 millilitersのSC two溶液に保存します。

この時点で肝臓は形態を失い、緊張がなく無定形な状態になります。マウス肝臓の消化の手順は、ラミナーフローフード内などの無菌条件下で実施してください。

鋭利なハサミを使用して、肝臓を約2×2×2 mm³の大きさに細断します。次に、70 mLのSC 2懸濁液と細断した肝臓を、50 mLのプロテアーゼ E・コラゲナーゼ P溶液と混合します。1 mLのdna, one溶液を加え、撹拌しながら37 °Cで20分間、肝臓を消化させます。

肝組織を酵素消化した後、密度勾配遠心分離法を用いて星細胞を他の肝細胞型から分離します。この手順を開始するには、細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過して6本の50 mLファルコンチューブに回収し、E2緩衝液で細胞を洗浄し、600 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。遠心分離後、各チューブから上清を40 mL慎重に吸引します。

次に、各チューブにDNAs one溶液を150 µL加え、細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を50 mLのFalconチューブ4本にまとめ、G-B-S-S-Pで洗浄した後、600 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、上清を可能な限り慎重に吸引し、各チューブにDNAs one溶液を150 µL加えます。

細胞ペレットを、1本あたり10 millilitersのG-B-S-S-Bに懸濁します。細胞を2本の50 milliliterファルコンチューブにまとめ、1本あたりの総量が36 millilitersになるまでG-B-S-S-Bを加えます。各チューブに14 millilitersのden solutionを加え、によく混ぜ合わせます。

次に、細胞懸濁液10 millilitersを12 milliliter勾配遠心チューブ1本に分注し、計10本のチューブを用意します。各チューブの細胞懸濁液の上に、G-B-S-S-B 1.5 millilitersを静かに重層します。勾配チューブを、1500 Gs、4 °Cで15分間、ブレーキなしで遠心分離します。

その後、肝細胞はチューブの底にペレットとして集まり、星細胞は界面に白いリング状に認められます。5 mLピペットを用いて、星細胞を含む界面を慎重に回収し、50 mLチューブに移します。GBSSを加えて洗浄し、600 G、4 °Cで10分間遠心分離します。

上清を吸引し、サプリメントを添加した20 millilitersのDMEMで細胞を再懸濁します。細胞数をカウントした後、2 × 10⁴ cells/cm²の濃度で組織培養フラスコに播種し、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で培養します。調製から約2時間後、肝星細胞が接着していることを確認し、培地を交換して死細胞や細胞残渣を洗浄します。

細胞をインキュベーターに戻します。本プロトコルを用いてマウス肝臓から肝星細胞を調製した際の代表的な結果をここに示します。in vitro培養1日目および3日目の細胞は、肝星細胞に特徴的な形態を示しています。細胞は星状の形態を呈し、脂質滴の蓄積が認められます。

核部位において、単離した肝星細胞の純度は、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）の発現によっても検証できます。これらの画像は、細胞単離後に3日間培養した肝星細胞におけるGFAPの代表的な免疫蛍光染色の結果を赤色で示しています。このビデオを視聴することで、十分な収量の純粋な星細胞を得るための、マウス肝臓からの肝星細胞単離方法について十分に理解できるはずです。

肝灌流において効率的な消化を確実にすることが重要です。最後に、肝胆道細胞の形態および表現型を評価し、単離した細胞の適切な正体を決定することが不可欠です。