細胞星状に7つのステップ

この手順の全体的な目的は、マウス肝臓から肝星細胞を単離することです。これは、まずマウス肝臓に消化酵素を用いた2回の灌流を行うことで達成されます。灌流後、肝臓を細かく切断して、次に行うin vitro消化の効率を高めます。

最終ステップとして、密度勾配遠心分離により肝星細胞を他の肝細胞型から分離します。最終的に肝星細胞が得られ、その純度は光学顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡によって評価することが可能です。本手順の実演は、研究室の大学院生であるPatrick Meyerが行います。マウス肝臓のNC two灌流の準備として、まずSC oneバッファーと酵素灌流溶液を37 °Cの恒温水槽で温めておきます。

次に、ペリスタルティックポンプを 6.5 milliliters per minute の層流が得られるように設定し、ポンプのシリコンチューブを SC one solution で平衡化します。ここで、反射の消失を確認し、麻酔下のマウスが深く鎮静されていることを確かめます。その後、マウスを適切な土台の上に仰臥位で固定します。

ハサミとピンセットを使用して腹壁に縦切開を加え、腹膜を露出させます。慎重に腹膜を開き、門脈を露出させるために腸管を腹腔外の動物の左側へ移動させます。この手順で最も困難な点は、消化酵素を用いた肝臓のゼト灌流（zeto perfusion）であり、これについて実演します。

次に、カニューレを挿入する際は実体顕微鏡を使用し、灌流中の肝構造の変化を注意深く観察することが重要です。実体顕微鏡下で、注入セットのカニューレを門脈に挿入します。30 millilitersのSC one溶液で肝臓の灌流を開始してください。流量の開始直後に、下大静脈を切開します。

肝臓の洗浄が成功すると、肝組織の色が消失します。次に、30 millilitersのPronase E溶液で肝臓を灌流します。Pronase E溶液による灌流後、肝葉が膨張し、被膜を通して小葉が明確に観察されるようになります。続いて、30 millilitersのcollagenase P溶液で灌流します。collagenase Pによる灌流が完了したら、肝臓を横隔膜および周囲の臓器から慎重に切り離して採取し、氷上の70 millilitersのSC two溶液に保存します。

この時点で肝臓は形状を失い、緊張がなく無定形な状態に見えます。マウス肝臓の消化手順は、ラミナーフローフード内で、無菌条件下で実施してください。

鋭い鋏を用いて、肝臓を約2×2×2mm³の大きさに切り刻みます。次に、70mLのSC 2懸濁液と肝臓片を、50mLのプロテアーゼEコラゲナーゼP溶液と混合します。1mLのdna, one溶液を加え、攪拌しながら37°Cで20分間、肝臓を消化させます。

肝組織を酵素消化した後、密度勾配遠心分離法を用いて星細胞を他の肝細胞から分離します。この手順を開始するには、細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過して6本の50 mLファルコンチューブに分注し、E2バッファーで細胞を洗浄した後、600 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。遠心分離後、各チューブから上清を40 mL慎重に吸引します。

次に、各チューブに150 µLのDNA's one溶液を加え、細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を4本の50 mL Falconチューブにまとめ、G-B-S-S-Pを用いて600 ×g、4 °Cで10分間遠心分離し、洗浄します。ペレットを乱さないように注意しながら、上清を可能な限り慎重に吸引し、各チューブに150 µLのDNAs one溶液を加えます。

各チューブにつき10 mLのG-B-S-S-Bで細胞ペレットを懸濁します。細胞を2本の50 mLファルコンチューブにまとめ、各チューブの総量になるまでG-B-S-S-Bを加えて36 mLにします。各チューブに14 mLのden solutionを加え、十分に混合します。

次に、細胞懸濁液10 millilitersを12 milliliterの密度勾配遠心管に分注し、計10本のチューブを用意します。各チューブの細胞懸濁液の上に、G-B-S-S-Bを1.5 millilitersずつ静かに重層します。その後、密度勾配を1500 Gs、4 °Cで15分間、ブレーキなしで遠心分離します。

その後、肝細胞はチューブの底にペレットとして回収され、星細胞は界面に白いリング状に認められます。5 mLピペットを用いて、星細胞を含む界面を慎重に回収し、50 mLチューブに移します。GBSSを加えて洗浄し、600 G、4°Cで10分間遠心分離します。

上清を吸引し、サプリメント添加DMEM 20 millilitersで細胞を再懸濁します。細胞数をカウントした後、組織培養フラスコに2 × 10⁴ cells/cm²の濃度で播種し、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。調製から約2時間後、肝星細胞が接着するため、培地を交換して死細胞および細胞残渣を洗浄します。

細胞をインキュベーターに戻します。本プロトコルを用いてマウス肝臓から肝星細胞を調製した代表的な結果をここに示します。in vitro培養の1日目および3日目の細胞は、肝星細胞に特徴的な形態を示しています。細胞はアストロサイト様（星状）の形態であり、脂質滴の蓄積が認められます。

核部位において、単離した肝星細胞の純度は、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）の発現によっても確認できます。これらの画像は、細胞単離後に3日間培養した肝星細胞におけるGFAPの代表的な免疫蛍光染色（赤色）を示しています。このビデオを視聴することで、純度の高い星細胞を十分な収量で得るために、マウス肝臓から肝星細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。

肝灌流時に効率的な消化が行われるようにすることが重要です。最後に、肝細胞の形態と表現型を評価することで、単離された細胞の正体を適切に特定することが不可欠です。