Name: 傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 学ぶCD8⁺T細胞による膵β細胞傷害の評価法。¹⁵¹Cr放出アッセイとライブイメージングを用いて、1型糖尿病における自己免疫性細胞死メカニズムをリアルタイムで可視化する手法を解説します。

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この作品は、健康DK074656とAI56374（CEM）の国立研究所からの補助金だけでなく、若年性糖尿病研究財団によってサポートされていました。

1。細胞の調製<ol><li>標的細胞培養：マウスのβ細胞株、NIT - 1及びNIT - 4の培養は、10％FBS、0.02％BSA、非必須アミノ酸、15mmのHEPES、16.5を含むDMEMで前に説明した1,2だったGlocoseおよびペニシリン/ストレプトマイシン。 5 × 10 4細胞で平底96穴培養プレートの51 Crのラベル、種子の細胞/ウェル200μlの培養培地中のため。顕微鏡実験、500μlの培養培地中のチャンバーあたり5 × 4で8ウェルのLab -徳IIチャンバーカバーガラスの種子の細胞、および細胞毒性実験に使用する前に48時間のために成長することができます。 </li><li>制御性T細胞株の培養：陰性コントロールとしてJurkat細胞細胞株（ATCC、CD3 +ヒトリンパ球細胞株）を使用してください。 RPMI1640で培養したJurkat細胞は10％FBS、2mMのL -グルタミン、1.5 g / Lの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPESおよび1.0mMのピルビン酸ナトリウムを補充した。 </li></ol> 2。エフェクター自己反応性CD8 + T細胞の収集と活性化 NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcraAI4）1Dvs/DvsJは[NOD - AI4a]とNOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcrbAI4）1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b]ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から購入し、私たちのマウスの施設で飼育。とNOD - AI4aの交配からのF1雑種子孫NOD - AI4b [NOD - AI4a / b]の年齢の3〜5週間で糖尿病を発症する。すべてのマウスは、特定病原体フリーの施設に収容され、関連する機関の動物実験委員会によって承認された。 <ol><li> CO 2を使用して3から4週齢のNOD - AI4a / Bマウスを安楽死させる。 </li><li>マウスから脾臓を収集する。安楽死させたマウスは、エタノールを噴霧して準備し、手術のフードの下で開かれます。脾臓を除去し、直ちに氷冷したHBSSバッファに置かれます。 </li><li> 7 mLのガラスホモジナイザーを用いて脾細胞を収集する。 2〜3脾臓それぞれは冷たいHBSS 5mLに入れ、7 mLのガラスホモジナイザーでホモジナイズされています。ホモジネートを4℃で5分間、1200rpmで収集し、遠心分離され° CソーバルRT7 +遠心分離機を使用して。細胞ペレットが収集されます。 </li><li>低張液処理を用いて赤血球を削除します。ペレットを、HBSSの等量を加えて中和、5分間氷上で5 mLの低張液/脾臓で処理されています。上記のように、遠心分離によって細胞を回収し、50mlのHBSSに再懸濁します。セルストレイナーを通して浮遊細胞を渡すとTrypanBlue染色と血球計数器を用いてカウント。 </li><li>細胞を活性化させる。 RPMI1640で0.1μMAI4 mimotope（アミノ酸配列のYFIENYLEL）および25 U / mLのIL - 2で3日間培養を用いて5 × 10 6 / mLおよび活性化における再懸濁し、細胞は10％FBSを補充し、2mM L -グルタミン、1.5グラム/ Lの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPESおよび1.0mMのピルビン酸ナトリウム。 </li></ol> （3）51 Cr放出アッセイは、CMLを検討する<ol><li>ラベルの標的細胞：3時間1μCi/ウェルと文化で細胞を標的とし、培養液で3回洗浄するための51 Crを追加する。 </li><li>ステップ2.5で述べたように、それぞれに追加された最後のボリュームが十分に200μlになるようにRPMI1640培地にエフェクター細胞を一時停止する。 </li><li>比率：標識した標的細胞の最終洗浄後、ターゲット（T E）にエフェクター希望で、標的細胞の培養に活性化エフェクター細胞を加える。 0.4:1、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1と50:1でT比：我々は、通常のEを使用してください。 </li><li>自発的な溶解のコントロールとして動作するように標的細胞の6ウェルに新しい改変RPMI 1640培地を（ステップ2.5参照）を追加します。 </li><li> 16時間共培養エフェクターと標的細胞。 </li><li> 6x50 mm黄ガラスチューブに上清を収集する</li><li> 100μlの2％SDSを添加すると軽く数回ピペッティングして細胞を溶解する。 </li><li> 6x50 mm黄ガラス管の別のセットで細胞ライセートを収集する。 </li><li>クリーンなH 2 Oで一回井戸を洗浄し、細胞溶解液のチューブに洗浄液を加える。 </li><li>ガンマカウンターを用いて上清および細胞溶解物を数える。 </li><li>次のように特異的溶解を計算します。 <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="式（1）"></li></ol> 4。生細胞イメージングのための細胞の染色最も一般的に使用されるミトコンドリア膜電位の染料の中で、TMRMが少なくともミトコンドリア毒性を示す。従って3、我々はこれらの生細胞イメージング研究のためのTMRMを選択してください。 <ol><li> -20℃でDMSOと店舗では40 mMストックTMRMの溶液を調製[25 nMの] NIT - 1細胞培養1のすべてのサプリメントとフェノールレッドを含まないDMEMで新鮮な実用的なソリューションを行います。 </li><li> 37℃で30分間TMRM 25nMの持つターゲットNIT - 1細胞​​を染色℃に</li><li>染料4の平衡分布を維持するために5nmのTMRMを含む新鮮な培地を使用してメディアを交換してください。 </li><li>血球計数器を用いて活性化エフェクターAI4 T細胞を数える。 </li><li> 1μL/ mLのPicogreen用で活性化したエフェクターAI4 T細胞を染色フェノールレッドを含まない培地で室温と洗浄で5分間3回。 </li></ol> 5。生細胞イメージングを用いて評価するTリンパ球が介在するβ細胞死<ol><li>ツァイスLSM 510共焦点顕微鏡のステージ上で染色されたNITの細胞をチャンバーカバーガラスをマウントします。 etheline酸化物とチャンバーのガラスを殺菌dremmelとガスでタブを削除します。ステージは、37の温度を制御している生細胞イメージングチャンバー℃、5％の水分とCO 2が装備されています。 </li><li>アクティブに追加し、別のEで指定されたチャンバーに染色したT細胞：T比。 </li><li>制御室に染色したJurkat細胞の同じ数を追加しました。 </li></ol> 6。生細胞の画像を取得顕微鏡は、私たちは繰り返し実験の時間の経過とともに自動的に同じまたは別のチャンバーから別の場所で画像を取得するために許可されて電動ステージを装備しています。 <ol><li> 63x油浸対物レンズを使用して、場所ごとに300フレームの合計で3分ごとの間隔で画像を撮影する。 </li><li>発光565〜619 nmの励起波長543 nmの長さとフィルターのセットを使用してTMRM染色を検出</li><li>励起波長488nmおよび発光500〜630 nmのフィルターセットを使用してPicogreen染色を検出する。ビデオは、ツァイスLSMソフトウェアを使用して作成されました。 </li></ol> 7。出版物のためのビデオ変換<ol><li>ツァイスLSMソフトウェアを使用して、AVI形式で圧縮されていないムービーファイルを作成します。 </li><li>公開されたフォーマットにビデオを変換するには、ソフトウェアパッケージフィジー（にビデオをインポート<a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ）、ImageJを（ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info。 nih.gov / IJ /</a>遺伝子座（からBioformatsプラグインを使用して）配布、 <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ）。 </li><li>緑と赤の信号のバランスをとるために明るさとコントラストの設定を調整し、フレームレートは、アニメーションのオプションメニューを使用して、2フレーム/秒に設定されていました。 </li><li>非圧縮のAVIファイルとして512 × 512ピクセル、輸出するビデオをトリミング。 </li><li>ソフトウェアのQuickTime 7（アップルコンピュータ、カリフォルニア州クパチーノ）は、このAVIファイルを開き、1200 KBS /秒で圧縮して、開いているビデオファイル形式H264/MPEG-4でエクスポートする。 </li></ol> 8。代表的な結果： <ol><li> の51 Cr CMLアッセイの代表的な結果。ターゲットの比（X軸）の増加：図1は、パーセント特異的溶解（Y軸）がエフェクターとして増加CMLアッセイの代表的な結果を示しています。標的細胞は、免疫不全NODから分離された主要な島ですRAG1 - / -マウスと51 Crで標識した。上記のステップ2で説明したようにNOD.AI4α/βトランスジェニックマウスから脾細胞を単離し、活性化される。ターゲットとエフェクターを16時間共培養した。上記のステップ3.11に説明するようにパーセント特異的溶解が計算されます。 </li><li> T細胞媒介性のβ細胞のミトコンドリア膜電位損失の二つの代表者（正および負）の結果が表示されます。細胞が染色されたものであり、手順4、5、6で説明したように反応が記録され、ビデオファイルは、手順7のように作成されます。ビデオ1：マウスの​​β細胞株NIT - 1はミトコンドリアの膜電位色素TMRM（赤）を染色した。 50:1のT比：活性化、自己反応性CD8 + T細胞AI4（Picogreenで染色緑）は、これらのNIT - 1 Eで細胞と共培養した。 NIT - 1 400分の持続時間の間、だけAI4 T細胞と相互作用されたクラスタで徐々に消費されるミトコンドリア膜電位。ビデオ2：50:1のT比：対照実験として、NIT - 1細胞​​をTMRMとEでPicogreenステンドJurkat細胞と共培養して染色した。 Jurkat細胞は、一致しないMHCであるヒトT細胞株です。 NIT - 1細胞​​は、400分の共同潜伏期間の全期間を通じてミトコンドリアの膜電位を維持した。 Jurkat細胞は、NIT - 1のクラスターと相互作用しておらず、したがって、殺す誘導しない。 </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="図1"> NOD.AI4α/βトランスジェニックマウスからのマウスおよび脾細胞- 。標的細胞免疫不全NOD.Rag1 - /から分離された主要な島として使用してCMLの図1代表的な結果。ターゲットとエフェクターを16時間共培養した。エフェクターとしてパーセント特異的溶解が増加：ターゲットの比率が増加する。 ビデオ1。マウスのβ細胞株NIT - 1はミトコンドリアの膜電位色素TMRM（赤）を染色した。 50:1のT比：活性化自己反応性CD8 + T細胞AI4（Picogreenで染色緑）は、これらのNIT - 1 Eで細胞と共培養した。 NIT - 1のミトコンドリア膜電位のdissipa徐々に400分の期間中、しかし唯一の緑AI4 T細胞と相互作用していたクラスタのテッドは。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">ビデオを見るにはここをクリック</a> 。 ビデオ1とPicogreen染色したヒトT細胞株Jurkatと共培養で説明したようにビデオを2。NIT - 1細胞は同じ染色した。 NIT - 1細胞​​は、ミトコンドリア膜電位400分の持続時間を考えを維持することができた。 Jurkat細胞は、NIT - 1のクラスターと相互作用していないため、殺害を誘発しない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">ビデオを見るためにここをクリック</a> 。

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
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<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

動物実験は、フロリダ大学の動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

細胞傷害性T細胞を介したβ細胞死は、T1D 5の主な病態である。 51 Cr放出を用いたCMLアッセイは、私たちはエフェクター-ターゲットの反応6の度合いを調べることができます。しかし、詳細なプロセスと、T細胞媒介性のβ細胞死の経路はまだ完全には理解されていない。ミトコンドリアは、β細胞機能と死7の重要なので、我々は、視覚的なCMLの間にミトコンドリアの変化に焦点を当てた。ミトコンドリア膜電位の散逸は、アポトーシス8につながるミトコンドリアの機能変化の早期にかつ不可逆的なステップです。共焦点顕微鏡のライブセルイメージングを使用して、我々は、自己反応性Tリンパ球との相互作用中にβ細胞のミトコンドリア膜電位の散逸を可視化することができた。この実験的な設定は、T1Dの開発中のベータ細胞に何が起こるかの少なくとも一部を模倣しています。この実験のような制限があります：8ウェルのLab -徳IIチャンバーカバーガラス（同時に治療の記録とコントロール用）、ハンドルを使用する際にツァイスの顕微鏡を装備した生細胞イメージングのための加熱インサート...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> CR - 51 </td><td>パーキンエルマー</td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM） </td><td>インビトロジェン</td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td>インビトロジェン</td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td>アミノ酸配列：YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL - 2 </td><td> R＆D </td><td> 485 - MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25から060 - Clを</td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>双子座</td><td> 400から109 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まないDMEM </td><td>シグマ</td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2インキュベータ</td><td>サーモフィッシャー</td><td> HeraCell 150i </td><td>細胞培養用の滅菌保管</td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>フォーマ1440 </td><td></td></tr><tr><td>使い捨て文化のチューブ、6x50 mm黄ガラス</td><td>フィッシャー</td><td> 14から958 - </td><td></td></tr><tr><td>ガンマカウンタ</td><td>パーキンエルマー</td><td>ウィザード1470自動ガンマカウンター</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> LSM 510共焦点メタ</td><td>電動ステージと生細胞のチャンバーで</td></tr><tr><td>ピペット（1ミリリットル、200μlの、20μlの、10μlの、2μlの） </td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ（アンバー） </td><td>フィッシャー</td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>ソーバルレジェンドRT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcraAI4）1Dvs/DvsJマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcrbAI4）1Dvs/DvsJマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD -AI4α/βF1マウス</td><td> N / </td><td> N / </td><td>フロリダ大学の動物施設で飼育</td></tr></tbody></table>

傷害性tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

1型糖尿病（T1D）は、T細胞媒介性自己免疫疾患である。インスリン産生が失われると病因の間に、患者は、T細胞による膵β細胞の破壊から、おそらくこの結果は、次第にinsulinopenicになる。 T1Dの開発中にベータ細胞死のメカニズムを理解することはこの病気のための効果的な治療法を生成するための洞察を提供します。細胞媒介lymphocytotoxicity（CML）アッセイは、歴史的に標的細胞を標識する放射性核種クロム51（51 Cr）を使用している。これらのターゲットは、エフェクター細胞に曝露されており、標的細胞からの51 Crの放出は、リンパ球が介在する細胞死の指標として読み込まれます。 51 Crの減少のリリースでは細胞死の結果の阻害剤。 エフェクター細胞として、我々はAI4 T細胞受容体（TCR）のαとβ鎖の両方のためのマウスの株式のトランスジェニックから分離されたCD8 +細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の活性化自己反応性クローン集団を使用する。活性化さAI4 T細胞が16時間の51 Cr標識標的NITの細胞と共培養された、51 Crの放出は、特異的溶解を計算するために記録されたミトコンドリアなどのエネルギー生産、伝達をシグナル伝達の調節、およびアポトーシスなどの多くの重要な生理学的なイベントに参加。 T1Dの開発中のベータ細胞のミトコンドリアの機能変化の研究は、研究の新たな領域です。ミトコンドリア膜電位色素テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）と共焦点顕微鏡、ライブセルイメージングを使用して、我々は、β細胞株NIT - 1で時間をかけてミトコンドリア膜電位をモニターする。イメージング研究のために、エフェクターAI4 T細胞は、蛍光核染色色素Picogreenで標識した。 NIT - 1細胞とT細胞はチャンバーカバーガラスで共培養し、生細胞のチャンバーを装備した顕微鏡ステージに搭載された、37℃に制御された° C、5％CO 2、及び加湿付き。これらの実験中にイメージは、各クラスタから400分毎に3分を採取した。 400分のコースで、我々はAI4 T細胞が接続されていたNIT - 1細胞​​クラスターのミトコンドリア膜電位の散逸を観察した。 NIT - 1細胞​​はMHCの不整合ヒトリンパ球Jurkat細胞と共培養した同時対照実験では、ミトコンドリアの膜電位はそのまま残った。この手法は、細胞傷害性リンパ球、サイトカイン、または他の細胞毒性試薬の攻撃を受けて細胞内のミトコンドリア膜電位のリアルタイムの変化を観察するために使用することができます。

細胞媒介のlymphocytotoxicity（CML）アッセイは、in vitroにおける自己反応性応答と細胞死の研究のメカニズムをテストするために使用することができます。しかし、蛍光染料、型と細胞死だけでなく、利用経路の動態と生きた細胞の共焦点顕微鏡イメージング技術を用いてより詳細に調べることができる。

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

1型糖尿病（T1D）は、T細胞介在性の自己免疫疾患である。その病態形成過程において、インスリンが……となるにつれ、患者は漸次的にインスリン欠乏状態となる。

1型糖尿病は、自己反応性T細胞によってインスリン分泌膵β細胞が破壊される自己免疫疾患です。その関与メカニズムを解明することは、この疾患に対する効果的な治療法を創出するための洞察をもたらします。本動画では、in vitroで特定のCD8陽性T細胞による膵β細胞の破壊を観察するための2つの手法、すなわち$^{51}\text{Cr}$を用いた細胞媒介性リンパ球細胞毒性（CML）アッセイと、視覚的なCMLアッセイについて解説します。CMLアッセイを実施するため、まずマウス脾臓からCD8陽性Tエフェクター細胞を調製します。Knit 1またはKnit 4標的β細胞をクロム51で標識し、エフェクター細胞と共培養します。標的β細胞が死滅すると、クロム51が放出されます。その後、上清と細胞溶解物を回収し、細胞死の程度を示す放射能レベルをガンマカウンターを用いて測定します。視覚的CMLアッセイを実施する場合、Knit 1およびKnit 4標的β細胞をミトコンドリア膜電位染色剤TM RMで標識し、エフェクター細胞をPicoGreenで標識します。細胞を混合し、ミトコンドリア膜電位の消失によって示される細胞死の速度を調べるために、生細胞イメージングを行います。クロム放出アッセイなどの従来のアッセイに対するこのアッセイの主な利点は、β細胞の死をリアルタイムで観察できることです。その他の利点としては、CD8 T細胞介在性のβ細胞死が接触依存的であるかどうかを判定できることや、蛍光指示薬を用いてβ細胞死の経路をマッピングするためにこのアッセイを拡張できることが挙げられます。この手法は、細胞傷害性T細胞が関与するあらゆる疾患の発症機序における重要な疑問を解決することができます。ミトコンドリア機能はベータ細胞の生存と生理学的機能の両方において不可欠であるため、この技術の意義は治療、そしておそらく診断にまで及びます。Jing Chenと私がこの手順を実演します。このデモンストレーションで使用する標的細胞は、マウスβ細胞株であるKnit 1およびKnit 4です。マウスβ細胞を認識せず殺傷しないJurkat CD3+ヒトリンパ球細胞株を陰性対照として使用します。エフェクター細胞として使用するのは、3〜4週齢のNOD/AI4αβ F1マウスの脾臓から得られた自己反応性CD8+ T細胞です。細胞を回収するには、まず脾臓を5 mLの氷冷HBSSを含む7 mLガラス製ダウンホモジナイザーに入れます。ダウンホモジナイザーを用いて脾臓をホモジナイズし、次いで細胞懸濁液をコニカルチューブに移し、250 Gで5分間遠心分離します。遠心後、上清を廃棄します。次に赤血球を除去するため、脾臓1個あたり5 mLの低張溶液でペレットを再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞ペレットを10 mLの氷冷HBSSで2回洗浄し、遠心分離します。各洗浄の間、細胞懸濁液を10 mLの氷冷HBSSで再懸濁します。その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントし、細胞数を決定します。再度遠心分離し、補充済みRPMI 1640を用いて細胞を5 × 10⁶ cells/mLの密度で再懸濁します。T 75フラスコに、5 × 10⁶ cells/mLの密度で細胞を播種します。最後に、細胞を活性化させるため、最終濃度がそれぞれ0.1 µMおよび25 units/mLとなるようにAI four myopeとIL twoをフラスコに添加します。フラスコを5% CO2インキュベーターにて37 °Cで3日間培養します。これで活性化した細胞を、ACROMIUM 51ベースのCMLアッセイまたは視覚的CMLアッセイのいずれかに使用できます。ここでの細胞介在性リンパ球細胞毒性（CML）アッセイでは、標的細胞からのchromium 51の放出を、CD8介在性のβ細胞死の指標として用います。knit 1またはknit 4標的β細胞をchromium 51で標識するには、まず、サプリメント添加DMEM 200 µLを用いて、96ウェルプレートに5 × 10⁴ cells/wellの密度で播種し、37 °C、5% CO2で24時間インキュベートします。翌日、chromium 51をサプリメント添加DMEMで希釈し、濃度を1 µCi/20 µLに調整します。次に、標的β細胞を含む各ウェルに、1ウェルあたり1 micro curieとなるように、希釈したchromium 51を20 µLずつ加えます。プレートを5%CO2を含む37 °Cの加湿インキュベーターに入れ、3時間インキュベートします。その後、培地を吸引し、新鮮な培地で細胞を3回洗浄します。次に、活性化したCD8陽性エフェクター細胞に培地を加え、各ウェルへの最終添加量を200 µLにします。ここで、目的のE:T比でエフェクター細胞と標的β細胞の培養物を混合します。自発的溶出コントロールを調製するために、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、および0.25:1の比率を用います。標的β細胞の6つのウェルに新鮮な培地を加えます。その後、プレートをインキュベーターに入れ、エフェクター細胞とターゲット細胞を16時間共培養します。翌日、マルチチャンネルピペットを使用して、上清を50 mmのライムガラスチューブ6本に分注します。次に、細胞を溶解させるため、プレートに100 µLの2% SDSを加え、ピペッティングで静かに数回混ぜ合わせます。細胞溶解物を、新しい6本の50 mmライムガラスチューブに転移させます。次に、すべての細胞溶解物を確実に回収するため、各ウェルに100 µLの滅菌水を追加し、ピぺッティングを行ってから細胞溶解物チューブに加えます。その後、ガンマカウンターを用いて上清および溶解物の放射能を測定し、β細胞の破壊度を決定します。この式に示すように、実験用上清のカウント率から自発的溶解コントロール上清のカウント率を差し引くことで、特異的溶解率を決定します。T細胞介在性のβ細胞死をリアルタイムで解析するため、標的細胞とエフェクター細胞の共培養系において、ライブセルイメージングによりミトコンドリア膜電位をモニタリングします。顕微鏡観察の準備として、改良および滅菌済みの8ウェルチャンバーカバーガラス上に標的となるβ細胞を5 × 10⁴個/ウェルの密度で播種します。スライドを37 °C、5% CO₂のインキュベーターに入れ、48時間培養します。実験当日、25 nMのミトコンドリア膜電位染色剤であるテトラエチルベンジミダゾリウムメチルエステル（TMRM）を含むフェノールレッドフリーの補完DMEMを添加し、30分間インキュベートします。細胞をTMRMで染色した後、色素の平衡分布を維持するため、培地を5 nMのTMRMを含む新鮮な培地に交換します。次に、ヘモサイトメーターを用いて活性化エフェクターT細胞またはコントロールJurkat細胞をカウントし、適切な濃度になるように、フェノールレッド不含のサプリメント添加DMEMを用いて15 mLコニカルチューブ内で細胞を再懸濁します。続いて、活性化エフェクター細胞またはJurkatコントロール細胞に、最終濃度が1 µL/mLとなるようにPicoGreenを添加します。チューブをアルミホイルで包んで遮光し、インキュベーション後、室温で5分間静置します。フェノールレッドフリーのDMEMを加えて軽く混ぜ、250 GSで5分間遠心分離する操作を3回繰り返し、細胞を洗浄します。イメージング用に細胞を回収するため、電動ステージと37 °C、5%CO2に設定された加湿生細胞イメージングチャンバーを備えた共焦点顕微鏡のステージにチャンバースライドを設置します。活性化しPico Greenで染色したエフェクター細胞を、評価対象とするエフェクター対ターゲット比（ET比）に従ってチャンバーに添加します。ここではET比を50:1としてイメージングを行い、イメージングソフトウェアを、4つのウェルで各3箇所、3分ごとに1箇所あたり300フレームを収集するように設定し、TMRMおよびPico Greenに適したフィルターセットを用いて励起させます。すべての画像を収集した後、出版用に変換する必要があります。FijiとImage Jを、lociのbio formatsプラグインと共に使用します。ビデオ変換に関する詳細は、付属の解説文をご参照ください。このビデオで説明されている通り、クロム51を用いた細胞媒介性リンパ球細胞毒性（CML）アッセイを実施しました。ここに示すように、Y軸に示される特異的溶解率（%）は、X軸のエフェクター対ターゲット比の上昇に伴って増加しています。ライブセルイメージングによる細胞死を評価するため、マウスβ細胞株NIT-1をミトコンドリア膜電位色素TMRM（赤色）で染色し、活性化自己反応性I-4 CD8陽性T細胞をpico green（緑色）で染色し、ここに見られるようにE:T比50:1で2種類の細胞を共培養しました。400分間の観察期間中、NIT-1のミトコンドリア膜電位は徐々に消失しましたが、これは緑色のI-4 T細胞と相互作用しているクラスターにおいてのみ認められました。対照実験として、染色したNIT-1細胞を、ここに見られるようにpico greenで染色し、MHC不一致のヒトJurkat T細胞と共に培養しました。Knit one細胞は、400分間にわたってミトコンドリア膜電位を維持することができました。Circuit細胞はknit oneクラスターと相互作用しなかったため、死滅を誘導しませんでした。習得後。この手法は、細胞の調製を含めて約5日かかります。このビデオを視聴することで、自己反応性T細胞の攻撃を受けた際にβ細胞の膜電位がどのように変化するかを十分に理解できるはずです。放射性同位元素を取り扱う際は危険が伴うため、本手順の実施にあたっては、適切なトレーニングを受け、十分な予防策を講じることを忘れないでください。

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