同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

本手順の全体的な目的は、同種造血幹細胞移植（HSCT）レシピエントへの養子移殖に適した、ドナー由来のウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を迅速に作製することです。まず、ウイルス抗原をコードするプラスミドを用いて樹状細胞（DC）を核転換（ヌクレフェクション）し、抗原提示能を誘導します。次に、核転換したDCを用いて抗原特異的T細胞を刺激し、その後、GASPAR（gas permeable culture device）と呼ばれるガス透過性培養装置内でIL-4およびIL-7の存在下で増殖させます。

次に、7日間の培養後、in vitroでのCTL増殖を最大限に維持するために、細胞を分割・継代し、培地を補充します。最終的に、12日目に細胞を回収して純度、力価、および安全性を試験し、その後の臨床使用に向けて凍結保存します。最終的に、細胞内サイトカイン染色、interferon gamma産生、および細胞毒性によって証明されるように、多種のウイルス特異性を持ち、アロ反応性が最小限であるCTL株を作製することができます。

多種のウイルス特異的細胞傷害性T細胞株の作製には、時間と手間がかかります。この手法では、EPstein-Barrウイルスによる形質転換B細胞株およびアデノウイルスベクターの使用が必要であり、手順に約3か月を要します。我々の新しい手法では、ウイルスベクターを使用しません。

細胞は培養中で最小限の細胞損失で指数関数的に増殖するため、この手順は迅速かつ費用対効果が高いものです。この手順を実演するのは、研究室の臨床フェローであるEureka Gerdemanです。IL-4およびG-M-CSFを添加したCellgenic培地で生成され、その後成熟サイトカイン中で24時間成熟させた単球由来DCを回収します。3 mL転送ピペットを用いて穏やかに懸濁します。トリパンブルーを用いてDCをカウントし、その後、1本あたり0.5 × 10⁶個以上2 × 10⁶個以下の細胞を3本の15 mLチューブに分注します。

次に、DCSを200 ×gで10分間遠心分離します。この間に、以前と同様のDC成熟サイトカインカクテルを添加したCellGenix培地を6 mL調製し、12ウェル組織培養処理プレートの3つのウェルに2 mLずつ分注します。使用しないウェルには滅菌水を2 mLずつ満たしてください。その後、プレートを37 °C、5% CO2のインキュベーターに入れ、予熱させます。

細胞の遠心分離が完了したら、上清を吸引し、各チューブに目的のDNAプラスミドを最終濃度が1チューブあたり5 µgとなるように加えます。ここでは、チューブ1にIE1 pp65をコードするプラスミドを、チューブ2にpentonを、チューブ3にEBNA1 LMP2 BZF1をそれぞれ添加しています。その後、100 µLの核導入溶液を用いてDCSとDNAを懸濁させます。

よく混ぜ合わせ、混合液をNucleofectorキュベットに移します。キュベットを4D-Nucleofectorにセットします。プログラムCB150を選択し、スタートボタンを押し、直ちにニュークレオフェクションを行います。

あらかじめ加温したCellgenic DC成熟培地を各チューブに500 µLずつ加え、ピペッティングで2〜3回穏やかに混ぜ合わせ、核酸導入されたDCを、残りの1.5 mLの加温済みDC成熟培地が入った準備済みの12ウェルプレートに移します。プレートをインキュベーターに移し、さらに12〜18時間培養した後、核酸導入されたDCを回収して計数します。細胞を10 mLのCTL培地で1回洗浄し、その後、培地1 mLあたり3×10⁵個のDCとなるように再懸濁します。3つの核酸導入サンプルすべてから、最小7.5×10⁵個（2.5 mL）から最大1.5×10⁶個（5 mL）のDCをプールし、プールしたプラスミド導入DCをG-Rexデバイスに移します。

次に、レスポンダー細胞の調製のため、デバイスをインキュベーターに入れます。DC選択後に残った非付着性単核細胞を使用してください。レスポンダー細胞を予め加温した培養液に移します。

CTL培地で一度洗浄します。細胞をCTL培地に懸濁させます。細胞数を計測し、濃度を2×10⁶ cells/mLに調整します。

15 × 10⁶個の細胞（または7.5 mL）を用意し、サイトカインのIL-4およびIL-7を添加します。7.5 mLのPBMCをG-Rexに移行し、CTL培地を加えてバイオリアクターの全量を30 mLにします。最後に、G-Rexをインキュベーター内に6〜7日間静置します。6〜7日目に、培地を10 mL吸引して回収します。

次に、10 mLピペットを用いて、残りの20 mLの培地を混合します。細胞数が50 × 10⁶個未満の場合は、トリパンブルーを用いて細胞数をカウントしてください。新鮮な培地とサイトカインを加えて、培養液を補充します。

細胞数が50 × 10⁶個を超えている場合は、細胞懸濁液を10 mL取り出し、新しいG rexに移植します。その後、両方のG rexに新鮮なCTL培地およびサイトカインを添加し、十分な細胞数まで増やすためにさらに4〜6日間培養してから、細胞を回収し計数します。次に、表現型解析または機能解析に使用しなかった細胞を、将来の使用に備えて凍結保存します。インターフェロンγ ELISPOTで測定した結果、マルチカセットDNAプラスミドがマルチウイルス特異的T細胞を誘導すること、および反応性細胞の頻度が、同じ抗原を発現する従来の単一プラスミドを用いて作製したラインよりも優れていることを示す代表的な結果です。

この図に示されているように、強力なT細胞刺激にはDCとPBMCの最適な比率が重要であり、1:50の比率では1:20の刺激細胞対応答細胞比に比べて再活性化が不十分であることがわかります。また、この図に見られるように、G rexを用いたCTL培養は、従来の24ウェルプレートと比較して優れたT細胞増幅をサポートします。培養液へのIL-4およびIL-7の添加は、増幅された細胞のレパートリーと特異性を向上させます。ここでは、IL-4および/またはIL-7の存在下または不在下で作製された培養物において、CMV PP65由来のHLA-A2制限NLVペプチドに対して反応性を持つT細胞の頻度を評価しています。この図は、急速に増殖したマルチウイルスCTLの表現型の代表的なサンプルを示しており、これらはCD4陽性およびCD8陽性T細胞の混合物であるポリクローナルな細胞であり、その大部分がメモリーマーカーであるCD45ROおよびCD62Lを発現しています。増幅されたCTLはすべての刺激抗原に対して特異的であり、また多機能性であることも、クロム放出試験による評価後の抗原刺激に伴うインターフェロンγおよびTNF-αの産生を検出するための細胞内サイトカイン染色によって、ここで評価されています。

増殖させたCTLはウイルス標的を特異的に殺傷することが可能ですが、非ウイルス性のHLAミスマッチ標的に対しては非特異的な活性を示さず、これは安全性における極めて重要な検討事項となります。このビデオを視聴することで、GNP適合性があり、ウイルス関連疾患の患者への養子移殖に適した、マルチウイルス特異的な細胞傷害性T細胞株を迅速に製造する方法について十分に理解できるはずです。この手順を簡略化することで、専門的な製造施設以外への展開が容易になり、免疫不全でウイルス関連疾患に非常に罹患しやすい患者にとって、本手順が標準治療となることが期待されます。