Name: 同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ 同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防・治療するためのマルチウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の迅速生成法。樹状細胞のヌクレオフェクションとG-Rex培養装置を用いたGMP準拠プロトコルです。

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この作品は、細胞治療（契約NIH - NHLBI（HB - 10 - 03）HHSN26820100000C）（CMR）、細胞ベースの治療のための専門センターの生産支援によってサポートされている補助金NIH - NHLBI 1 U54 HL081007（CMR）、ASBMT若手研究者賞（UGおよびJV）、臨床研究賞（UG）の白血病とリンパ腫協会特別研究員、およびエイミーStrelzer Manasevit Scholarの賞（AML）。

1。直流nucleofection <ol><li>セルGenix IL4（1000U/ml）を添加したメディア、GMCSF（800IU/ml）、さらに、DCの成熟のサイトカインIL4を（1000Uを使用して24時間熟成を使用して5日間培養プラスチック接着を、使用して濃縮されている収穫単球由来樹状細胞、 / ml）を、GMCSF（800IU/ml）、IL6100ng/ml、TNF -α10ng/ml、IL1 -β10ng/mlとPGE2（1μg/mlの）1、3ミリリットルの転送ピペットで穏やかに再懸濁による。 </li><li>トリパンブルー、ないより少ない6 0.5 × 10以上と3倍の15ミリリットルチューブに転送し、これ以上の6 × 10以上の細胞/チューブを使用して実行可能な樹状細胞を数える。 </li><li> 10分@ 200グラムのための樹状細胞を遠心する。 37℃/ 5％CO 2インキュベーターでプレートを扱う12ウェル組織培養の3つのウエルに2ml/well -この時間の間に事前に暖かいセルGenixメディアは、DCの成熟のサイトカイン（DC成熟のメディア）を補充した。 </li><li>一度細胞が回転し終わったら、上清を吸引し、5μgのDNA /チューブの最終濃度で管のそれぞれに関連するDNAプラスミドを追加します。この場合、チューブ＃3をコードするプラスミドチューブ＃1、ヘキソン-ペントン管に＃2〜IE1 - pp65を、およびEBNA1 - LMP2 - BZLF1を追加します。 </li><li> Amaxaのnucloefection液の100μLと再懸樹状細胞とDNAには、よく混ぜるとnucleofectionのキュベットに移す。 </li><li> 4D nucleofectorの場所のキュベットは、プログラムCB150（Amaxa /ロンザ）を選択し、スタートを押してください。 </li><li> nucleofectionがキュベットに2ミリリットル予め温めておいたセルGenix DCの成熟のメディアの500μLを追加した直後は、上下に2〜3回ピペッティングにより穏やかに混合し、あらかじめ温めておいたの残りの1.5mlを含む調製12ウェルプレートにnucleofected DCを転送するDCの成熟のメディア。 37譲渡℃/ 5％CO 2インキュベーターをさらに12 - 18hrsのために。 </li></ol> 2。 T細胞刺激<ol><li>収穫と30Gyでnucleofected DCをカウントし、照射。 CTLの培地10mlの（45％RPMI、45％のクリック数EHAA、10％FBS、2mMのグルタミン）とCTLメディアのmlあたり再懸@ 3 × 10 5のDCで1回洗浄します。 </li><li>プール各プラスミドを含む樹状細胞の7.5x10 5の最小値（2.5ミリリットル）と15x10 5の最大値（5ml）をして、インキュベータ内に配置されるG -レックスのデバイスにプールされたDCを転送する。 </li><li>応答細胞の調製については以前に​​凍結末梢血またはDCの選択（遵守またはCD14選択）した後に残っている非接着単核細胞のいずれかを使用してください。細胞を解凍、温めておいた培地に移す、CTL媒体で1回洗浄します。 CTLメディアで細胞を再懸濁し、細胞をカウントし、mlあたり2 × 10 6細胞の濃度にそれらをもたらす。 30000U IL4と15x10 6個の細胞または7.5ミリリットルとサプリメントを（。1000U/ml -最終濃度）に乗り、300ng IL7（10ng/ml -最終濃度。）。 </li><li> G -レックスと30ミリリットルの合計体積に対するCTLメディアとバイオリアクターまでトップにPBMCの7.5ミリリットルを（15x10 6個の細胞）に転送します。 </li><li>文化37の6-7日のためのG -レックス℃/ 5％CO 2の加湿インキュベーター。 </li></ol> 3。 T細胞の拡大<ol><li>日6-7、メディアの吸引10ミリリットルで、その後10ミリリットルピペットでメディアの残りの20ミリリットルの細胞を混合し、トリパンブルーを用いて生細胞を数える。ある場合は&lt;50x10 6は新鮮な培地+サイトカインを補給。 &gt; 50x10 6個の細胞が存在する場合、細胞懸濁液10mlのを削除し、新しいG - Rexに転送し、新鮮なCTLメディア+サイトカインとの両方G -レックスズを養う。 </li><li>追加の4-6日の培養。一度十分な細胞は、将来使用するためにCTLと低温保存する過剰の表現型および機能解析を行う、拡張されています。 </li></ol> 4。代表的な結果： 私たちのFDA承認multivirus特異的CTL生成プロセスの概略図を図1に示されています。ウイルス反応性T細胞を刺激するadenovectorsとEBV - LCLを使用する慣習multivirus CTLのプロトコルには対照2では我々はDNAプラスミドを感染性ウイルスの材料を交換したそのウイルス3のそれぞれから派生する複数の抗原をコード化する。 trivirusのCTL​​を刺激するために我々は3つのmulticistronicプラスミドエンコーディングヘキソンとペントンアデノウイルスの、CMVのIE1およびpp65を、およびEBNA1、LMP2、およびEBVのBZLF1を設計した。これらの抗原は、私たち自身の細胞やT細胞は、ADV -ヘキソンとペントン2,4-6に対して向けられることを示す他のグループの臨床結果を奨励し、CMV - 1E1、およびCMV - pp65をに基づいて選択された生体 7 の保護です。 EBVの場合、EBNA1は免疫CD4 +すべてのEBV関連悪性腫瘍で、通常のEBVに感染したB細胞で発現するT細胞の標的抗原である8,9、LMP2は、複数のHLAタイプにわたり、免疫原性であり、ほとんどのEBV悪性腫瘍に発現し、10,11 BZLF1中ほとんどの個体からのCD4 +およびCD8 + T細胞を刺激し、共同のために可能性が重要である免疫、即時初期の溶菌サイクルの抗原をコードしているウィルス12複製細胞のntrol。さらに私たちの製造方法を最適化するために我々は、CTL刺激13,14用minimalized、抗生物質フリー（FDA準拠）プラスミドを生成したネイチャーテクノロジーとのコラボレーション。としてIFNγのELISPOTにより測定された最適化されたDNAプラスミドに応答して高い細胞生存率（データは示していない）3。 図2に示すように、ウイルス特異的T細胞のその周波数を維持しながら、我々は一貫して&gt; 35％のnucleofection効率を達成するため、この戦略を使用して、大きい同じ抗原（N = 8アデノウイルスは、n = 4 CMV、およびn = 2 EBV）を発現する従来のpShuttleベースの発現プラスミドへの応答に比べて。 Rの比（n = 2のドナー）：DCの最適な比率：1:50の比は1：20 Sに比べて準最適な活性化を生成した図3に示すように、PBMCは、強力なT細胞刺激のために重要であった。広範な抗原特異性を有する十分なCTLの数値の生産は、すべての3つのウイルスに対する臨床的有効性の前提条件です。これは、 図4Bに示すように、文化へのIL4とIL7の加算がレパートリーと特異性を増加させる一方、従来の24ウェルプレート（ 図4A）15 日と比較して優れたT細胞の拡張をサポートするG -レックス、でCTL培養することによって達成されるCMV - pp65を由来HLA - A2に対する反応性T細胞の頻度がrestictedどこNLVペプチドは、IL4および/ ​​またはIL7 16,17の存在下または非存在下で生成された文化で評価した。我々はフローサイトメトリー解析、細胞内サイトカイン染色/IFNγELISPOT、および凍結保存/注入のための最終的な製品でCR 51放出アッセイを実行する拡張された細胞の表現型および機能的能力を評価する。一般的に生成された細胞はCD4 +および両方のT細胞区画において検出可能な抗原特異性CD8 + T細胞の混合集団とポリクローナルです。 CTLは、 生体内 （ 図5） に移植片対宿主病（GVHD）を誘導してはならないことを示す、ウイルス部分的にHLA一致の目標負ではないウイルス抗原を発現する標的細胞を殺すができるようになりました。 <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。rctlの生成プロトコル。最初に、樹状細胞は、ウイルス抗原をコードするプラスミドでnucleofectedし、Rにおける自家末梢血単核球と混合される：10または20:1のS。細胞は、その後、収穫、IL4とIL7の存在下で10〜14日間G -レックスに拡大して数え、機能、アイデンティティーと不妊の検査、およびその後の臨床使用のために凍結保存されています。 <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2。最適化されたDNAプラスミドは 、in vitro での優れたT細胞の活性化を誘発する。 DCは、最適化、FDAに準拠したプラスミド符号化ヘキソンとペントン（前売）、IE1およびpp65を（CMV）、およびEBNA1、LMP2、そしてBZLF1（EBV）または同じ抗原をコードする従来のpShuttleプラスミドでnucleofectedていた。これらはT細胞を刺激するために使用され、特異性は、IFNγのELISPOT 10日のポスト刺激により分析した。 <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3最適なDC：。CTL活性化のためのT細胞の比率。 2ドナーからの樹状細胞は、すべての3つの最適化されたプラスミドをnucleofectedしてから、1：20または1:50 DCで自家末梢血単核球を刺激するために使用されていました：PBMCの比率。再活性化T細胞の頻度は、IFNγのELISPOTにより、10日目に評価した。 <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。高めるサイトカインを用いたG -レックスのT細胞の拡大。パネルは、G -レックスのデバイスと同様に顕微鏡で評価したガス透過性膜、上のCTL外観を示しています。プレートVS G -レックス扱わ大会の組織培養で得セルの出力との間の比較も示されています。パネルBは、無サイトカインの存在下で拡大培養において達成CMV量体正のCTL、単独でIL4、IL7アローンおよびIL4 + IL7の周波数を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図5"> 図5。拡張されたCTLの表現型と機能。とCD8 +（42％ -細胞毒性） - パネルには、CD4 +（ヘルパー45％）の混合物とのポリクローナルな拡張multivirus CTLの表現型の代表的な例を示してT大多数（95％）が発現し、そのうちの細胞、メモリマーカーCD45RO + / CD62L +。 パネルBは、これらの細胞はすべての刺激抗原に特異的であり、IFNγの産生と抗原刺激後にTNFαを検出するために細胞内サイトカイン染色によって評価される多官能性であることを示しています。 パネルCは、拡張されたCTLは、測定されたとして機能していることを示していますCR 51アッセイによる。自家単独で、またはヌルベクトルまたはCMV - pp65をを発現するアデノウィルスベクターで形質LCLは、タールとして使用された取得。同種反応性は、ターゲットとして同種のPHA芽球を用いて評価した。

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フアンF.ベラは、ウィルソンウルフの製造のためのコンサルタントです。他の著者は、関連する開示はない。

ウイルス感染症は、自分の病気やその治療によって免疫不全患者ではかなりの罹患率と死亡率を占めている。 HSCT後は、例えば、EBVやCMV、だけでなく、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）などの呼吸器系ウイルスなどによって永続的なヘルペスウイルスによって引き起こされる感染症は、よく、知られているが、前売、BKウイルスによって引き起こされる感染症の重要性、そして人間のヘルペスウイルス（HHV）-6は、最近では評価されている。薬理学的薬剤はいくつかの感染症の標準治療であるが、彼らは実質的な毒性を持って、耐性変異株を生成し、そして頻繁に無効である。対照的に、幹細胞のドナー由来のウイルス特異的T細胞は、造血幹細胞移植（HSCT）の設定2,5,6,18-21のウイルス感染や病気の予防と治療のために安全かつ効果的であることが証明されている。しかし、T細胞免疫療法の広範な実装は、最終的にCTL産生に必要なコスト、複雑さと時間によって制限されます。 現在の原稿に記載されてmultivirus CTLを生成するために私たちの斬新かつ迅速なアプローチは、実質的に免疫不全宿主の標準治療になるための戦略を可能にする、ウイルス性疾患に対する細胞傷害性T細胞治療の実現可能性を増やす必要があります。 APCのようなプラスミドnucleofected DCの使用は、異なるDC集団はそれぞれのプラスミド3用に利用されているため、単一細胞内で発現している複数のウイルス抗原から実際にウイルスベクターやから競争することなくMHCクラスIおよびIIの両方に抗原提示を可能にします。 IL - 4月7日の使用も拡大しそれに応じて抗原特異的T細胞16,17の応答の頻度とレパートリーを増やすに役立つT細胞の生存や増殖、。最後に、G -レックスの文化は劇的に培養中のT細胞のアポトーシスを減らすことができます。ガス交換（のO 2とCO 2のうちは）より多くの栄養素を供給し、廃棄物を希釈し、細胞を上記培地の深みを許可しながら、低酸素症を防止する、フラスコの底にガス透過性のシリコン膜を横切って発生します。このプラットフォームはまた、防御抗原が同定されている場合など、追加のウイルスに拡張することができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R + Dシステムズ</td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td>ペプロテック</td><td> 200から15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td>ヒトAB血清</td><td>バレーバイオメディカル（株） </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa /ロンザ</td><td> AAF - 1001B＆AAF - 1001X </td></tr><tr><td> Nucleofectionキット</td><td> Amaxa /ロンザ</td><td> V4XP - 3012 </td></tr><tr><td>プラスミド</td><td> NTC </td><td> N / A </td></tr><tr><td> GM - CSF </td><td> R＆D </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R＆D </td><td> 201 - LB - 025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R＆D </td><td> 206 - IL - CF </td></tr><tr><td> TNFα </td><td> R＆D </td><td> 210 - TA - 010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td>シグマ</td><td> P6532 - 1mgの</td></tr><tr><td> G -レックス</td><td>ウィルソンウルフ製造</td><td> AY11 - 00027 </td></tr></tbody></table>

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するmultivirus -特異的t細胞の生成

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

ウイルス感染症は同種造血幹細胞移植（HSCT）受信者の罹患率と死亡率を引き起こす。我々と他の人が正常に生成し、エプスタインバーウイルス（EBV）、サイトメガロウイルス（CMV）と単球とを用いてアデノウイルス（ADV）のためのT -細胞特異的に注入しているEBV形質転換リンパ芽球様細胞を（EBV - LCL）アデノウイルスベクターでの遺伝子的に修飾された抗原提示細胞（APC）。として注入した後、いくつかのログで増殖した2 × 10 5 / kgのtrivirus特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）などのいくつかと他の利用可能な治療法に耐性をさらに深刻なウイルス性疾患の予防と治療に見えた。準備のための - この励みアプローチの広範な実装は、高い生産コスト、製造の複雑さと長時間（合計10〜14週CTLを製造するためのEBV - LCLの生成、および4-8週間4-6週間）によって制限されます。これらの制限を克服するために我々は新しい、GMP準拠のCTL生産のプロトコルを開発しました。最初に、我々は抗原提示のようなDNAプラスミドエンコーディングLMP2、EBNA1とBZLF1（EBV）、ヘキソンとペントン（前売）、およびpp65をとIE1（CMV）とnucleofected樹状細胞（DC）を使用するT細胞を刺激するadenovectorsの代わりに細胞。これらのAPCは、すべての刺激的な抗原に特異的なT細胞を再アクティブ化します。第二に、文化はIL - 4の存在下でT細胞を活性化（1,000 U / ml）とIL - 7（10ng/ml）が増加し、私たちの行で特定のT細胞のレパートリーと周波数を維持します。第三に、我々はこのようにEBV - LCLSのための要件を削除し、技術者の介入を減らし、単一の刺激の後に大規模な細胞数の拡大と生存を促進する新しい、ガス透過性培養装置を（G -レックス）を使用しています。これらの変更を実装することによって我々は今&gt; 90％削減され10 6細胞あたりのコストで、EBV、CMV、および前売をターゲットと多重CTLを生成し、可能な追加するために拡張できるアプローチを使用してわずか10日ではなく10週間で防御ウイルス抗原。私たちのFDA承認のアプローチは、リスクの高い同種HSCTレシピエントの予防と治療のアプリケーションのための値である必要があります。

の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

ウイルス感染は、同種造血幹細胞移植（HSCT）レシピエントにおける罹患および死亡の原因となります。我々および他の研究グループは、〜に成功してきました。

本手順の全体的な目的は、同種造血幹細胞移植（HSCT）レシピエントへの養子移殖に適した、ドナー由来のウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を迅速に作製することです。まず、ウイルス抗原をコードするプラスミドを用いて樹状細胞（DC）を核転換（ヌクレフェクション）し、抗原提示能を誘導します。次に、核転換したDCを用いて抗原特異的T細胞を刺激し、その後、GASPAR（gas permeable culture device）と呼ばれるガス透過性培養装置内でIL-4およびIL-7の存在下で増殖させます。次に、7日間の培養後、in vitroでのCTL増殖を最大限に維持するために、細胞を分割・継代し、培地を補充します。最終的に、12日目に細胞を回収して純度、力価、および安全性を試験し、その後の臨床使用に向けて凍結保存します。最終的に、細胞内サイトカイン染色、interferon gamma産生、および細胞毒性によって証明されるように、多種のウイルス特異性を持ち、アロ反応性が最小限であるCTL株を作製することができます。多種のウイルス特異的細胞傷害性T細胞株の作製には、時間と手間がかかります。この手法では、EPstein-Barrウイルスによる形質転換B細胞株およびアデノウイルスベクターの使用が必要であり、手順に約3か月を要します。我々の新しい手法では、ウイルスベクターを使用しません。細胞は培養中で最小限の細胞損失で指数関数的に増殖するため、この手順は迅速かつ費用対効果が高いものです。この手順を実演するのは、研究室の臨床フェローであるEureka Gerdemanです。IL-4およびG-M-CSFを添加したCellgenic培地で生成され、その後成熟サイトカイン中で24時間成熟させた単球由来DCを回収します。3 mL転送ピペットを用いて穏やかに懸濁します。トリパンブルーを用いてDCをカウントし、その後、1本あたり0.5 × 10⁶個以上2 × 10⁶個以下の細胞を3本の15 mLチューブに分注します。次に、DCSを200 ×gで10分間遠心分離します。この間に、以前と同様のDC成熟サイトカインカクテルを添加したCellGenix培地を6 mL調製し、12ウェル組織培養処理プレートの3つのウェルに2 mLずつ分注します。使用しないウェルには滅菌水を2 mLずつ満たしてください。その後、プレートを37 °C、5% CO2のインキュベーターに入れ、予熱させます。細胞の遠心分離が完了したら、上清を吸引し、各チューブに目的のDNAプラスミドを最終濃度が1チューブあたり5 µgとなるように加えます。ここでは、チューブ1にIE1 pp65をコードするプラスミドを、チューブ2にpentonを、チューブ3にEBNA1 LMP2 BZF1をそれぞれ添加しています。その後、100 µLの核導入溶液を用いてDCSとDNAを懸濁させます。よく混ぜ合わせ、混合液をNucleofectorキュベットに移します。キュベットを4D-Nucleofectorにセットします。プログラムCB150を選択し、スタートボタンを押し、直ちにニュークレオフェクションを行います。あらかじめ加温したCellgenic DC成熟培地を各チューブに500 µLずつ加え、ピペッティングで2〜3回穏やかに混ぜ合わせ、核酸導入されたDCを、残りの1.5 mLの加温済みDC成熟培地が入った準備済みの12ウェルプレートに移します。プレートをインキュベーターに移し、さらに12〜18時間培養した後、核酸導入されたDCを回収して計数します。細胞を10 mLのCTL培地で1回洗浄し、その後、培地1 mLあたり3×10⁵個のDCとなるように再懸濁します。3つの核酸導入サンプルすべてから、最小7.5×10⁵個（2.5 mL）から最大1.5×10⁶個（5 mL）のDCをプールし、プールしたプラスミド導入DCをG-Rexデバイスに移します。次に、レスポンダー細胞の調製のため、デバイスをインキュベーターに入れます。DC選択後に残った非付着性単核細胞を使用してください。レスポンダー細胞を予め加温した培養液に移します。CTL培地で一度洗浄します。細胞をCTL培地に懸濁させます。細胞数を計測し、濃度を2×10⁶ cells/mLに調整します。15 × 10⁶個の細胞（または7.5 mL）を用意し、サイトカインのIL-4およびIL-7を添加します。7.5 mLのPBMCをG-Rexに移行し、CTL培地を加えてバイオリアクターの全量を30 mLにします。最後に、G-Rexをインキュベーター内に6〜7日間静置します。6〜7日目に、培地を10 mL吸引して回収します。次に、10 mLピペットを用いて、残りの20 mLの培地を混合します。細胞数が50 × 10⁶個未満の場合は、トリパンブルーを用いて細胞数をカウントしてください。新鮮な培地とサイトカインを加えて、培養液を補充します。細胞数が50 × 10⁶個を超えている場合は、細胞懸濁液を10 mL取り出し、新しいG rexに移植します。その後、両方のG rexに新鮮なCTL培地およびサイトカインを添加し、十分な細胞数まで増やすためにさらに4〜6日間培養してから、細胞を回収し計数します。次に、表現型解析または機能解析に使用しなかった細胞を、将来の使用に備えて凍結保存します。インターフェロンγ ELISPOTで測定した結果、マルチカセットDNAプラスミドがマルチウイルス特異的T細胞を誘導すること、および反応性細胞の頻度が、同じ抗原を発現する従来の単一プラスミドを用いて作製したラインよりも優れていることを示す代表的な結果です。この図に示されているように、強力なT細胞刺激にはDCとPBMCの最適な比率が重要であり、1:50の比率では1:20の刺激細胞対応答細胞比に比べて再活性化が不十分であることがわかります。また、この図に見られるように、G rexを用いたCTL培養は、従来の24ウェルプレートと比較して優れたT細胞増幅をサポートします。培養液へのIL-4およびIL-7の添加は、増幅された細胞のレパートリーと特異性を向上させます。ここでは、IL-4および/またはIL-7の存在下または不在下で作製された培養物において、CMV PP65由来のHLA-A2制限NLVペプチドに対して反応性を持つT細胞の頻度を評価しています。この図は、急速に増殖したマルチウイルスCTLの表現型の代表的なサンプルを示しており、これらはCD4陽性およびCD8陽性T細胞の混合物であるポリクローナルな細胞であり、その大部分がメモリーマーカーであるCD45ROおよびCD62Lを発現しています。増幅されたCTLはすべての刺激抗原に対して特異的であり、また多機能性であることも、クロム放出試験による評価後の抗原刺激に伴うインターフェロンγおよびTNF-αの産生を検出するための細胞内サイトカイン染色によって、ここで評価されています。増殖させたCTLはウイルス標的を特異的に殺傷することが可能ですが、非ウイルス性のHLAミスマッチ標的に対しては非特異的な活性を示さず、これは安全性における極めて重要な検討事項となります。このビデオを視聴することで、GNP適合性があり、ウイルス関連疾患の患者への養子移殖に適した、マルチウイルス特異的な細胞傷害性T細胞株を迅速に製造する方法について十分に理解できるはずです。この手順を簡略化することで、専門的な製造施設以外への展開が容易になり、免疫不全でウイルス関連疾患に非常に罹患しやすい患者にとって、本手順が標準治療となることが期待されます。

generation-multivirus-specific-t-cells-to-preventtreat-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ 同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防・治療するためのマルチウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の迅速生成法。樹状細胞のヌクレオフェクションとG-Rex培養装置を用いたGMP準拠プロトコルです。

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

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