Name: 組換え可溶性GM - CSF受容体を用いてGM - CSF抗体の中和能を推定する無細胞アッセイシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学ぶGM-CSF抗体の中和能を無細胞アッセイで定量化する方法。組換え可溶性受容体を用いて結合阻害を評価し、従来のバイオアッセイと高い相関性を示す再現性のある測定システムを確立します。

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我々は彼らの貴重な貢献のためのK.中垣、博士石井、博士鈴木、A.山形、K. Oofusaに非常に感謝しています。

1。 sGMRαの生産と精製<ol><li>ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、ヒト胎盤cDNAライブラリーからsGMRαのcDNAを増幅する。 </li><li> Hisタグ別のPCRによるPCRアンプリコンの3'末端に50塩基のバキュロウイルスポリヘドリン最後の5' - UTR配列と27塩基のコーディングRGSを追加。 </li><li>プラスミドpMSG1.1MGに増幅されたPCR産物を挿入します。 </li><li>カイコPND - W1株の卵にpHA3PIGヘルパーのベクトルを持つ構造psGMR/M1.1MGを注入する。 </li><li> 25蛾のリア孵化したG0幼虫℃にトランスジェニックカイコがsGMRα遺伝子を有する得るために目にMGFP発現に兄弟間やPND - W1との交配によって得られる画面のG1の胚。 </li><li> 500mmのNaClを含むリン酸緩衝液をトランスジェニックカイコの繭から組換えsGMRαを抽出し、4℃で撹拌℃で24時間のために。 </li><li>沈殿除去するために15分を20000 gでサンプルを遠心する。 </li><li>ニッケル親和性カラムに上清を適用する。 </li><li> 10mMのイミダゾール、500mmのNaClおよび20mMのリン酸ナトリウム、pH6.3、および10mmから250mmのへのイミダゾールの直線勾配で溶出するとカラムを洗浄します。プール精製sGMRαを含む画分と液（pH7.4）リン酸緩衝生理食塩水に対して透析（PBS）。 </li></ol> 2。組換えGM - CSFのビオチン化<ol><li> PBSに対して透析によってソルビトール製剤を削除します。 </li><li> ℃の氷の上で解決するために4℃で20mMの冷ナトリウムメタ過ヨウ液を1ml追加。 </li><li>暗所で氷上で30分間サンプルをインキュベートする。 </li><li> 15mmの最終濃度で溶液にグリセロールを追加。 </li><li> 100mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）に対してソリューションを透析</li><li> 5mmの最終濃度の溶液にビオチンヒドラジドを追加し、継続的に室温で2時間のためのソリューションを撹拌。 </li><li> PBS、pH7.4の透析によって未反応物質を取り除きます。 </li></ol> 3。無細胞GM - CSF受容体 - リガンド結合アッセイ<ol><li>一晩4モノクローナル抗ヒスチジン抗体50μlのあるコートマイクロタイタープレート℃の</li><li> PBSTの500μLで5回洗浄する。 </li><li> 4℃で3時間のためのブロッキング溶液とインキュベート℃の100μLを加える</li><li> PBSTの500μLで5回洗浄する。 </li><li>ブロッキング溶液でsGMRα50μlのを追加し、4℃で一晩インキュベート℃、 </li><li> PBSTの500μLで5回洗浄する。 </li><li>その後、GM - CSF自己抗体とビオチン標識GM - CSFの25μlのを含むサンプルの25μlのを追加。 4℃で1時間インキュベート° CsGMRα- GM - CSFの複合体を形成する。 </li><li> PBSTの500μLで5回洗浄する。 </li><li> ° C、ビオチン化GM - CSF結合sGMRαを検出するために4℃で1時間のために0.4mmのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ50μlのを追加。 </li><li> PBSTの500μLで5回洗浄する。 </li><li>ソリューションに化学発光基質50μlのを追加し、室温で1時間インキュベートした。 </li><li>化学発光プレートリーダーを用いて、化学発光活性を検出する。 </li></ol> 4。代表的な結果： GM - CSF受容体のシグナル伝達経路の最初のステップは、細胞表面上にGM - CSF受容体αに対す​​るGM - CSFのバインディングです。 GM - CSF自己抗体が特にGM - CSFに結合し、in vitroで16,17の受容体への結合をブロックするため、我々は、自己抗体が直接的にGM - CSFに結合することによって、この最初の反応を抑制するという仮説を立てた。前述のように（文献9-15）、我々は高純度の組換えsGMRαを大量に得るために遺伝子組換えカイコ技術を適用。 唯一の単量体は還元条件下で検出されたのに対し、カイコ由来の組換えsGMRαが非還元条件下SDS - PAGEにロードされたときに、sGMRαは（図1B）、両方の単量体（45 kDa）と二量体（90 kDa）はフォームを示した、組換えsGMRαはモノマーとジスルフィド結合調光器18の混合物であることを示す。 無細胞系（図2A）を使用して、我々はGM - CSF自己抗体（図2Bおよび図2C）によるsGMRαにGM - CSF結合の阻害を評価した。これらのメソッドは、浦野らによって文献19に記述されている。増殖阻害は、密接にGM - CSF自己抗体（図3A）19の種々の濃度の結合阻害した（r = 0.988、P = 0.002）と相関していた。同様に、結合阻害は著しく成長の阻害と相関していた。結合阻害は、GM - CSF自己抗体（図3B）19によって用量依存的に増加した。別の患者からの血清IgG分画のため、これらの2つのパラメータが互いに相関した（R = 0.589、P = 0.006、図3C）。どちらの結合阻害も生育阻害は、Kd値と相関し、したがって、両方のパラメータは、結合親和性19によって影響を受けなかった。結合とgの間でデータの結果として再現性3つの異なるサンプル上の3つの独立した実験で得られたrowthの阻害を評価した。変動係数は、無細胞系は、バイオアッセイ（表1）のそれより優れていることを示した。 <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1トランスジェニックカイコを用いたsGMRαの生産のための手順のフローチャート。形質転換ベクター9-11 A）構造。還元および非還元条件下での精製sGMRαのB）SDS - PAGEとクマシーブリリアントブルー染色。 sGMRα、可溶性のGM - CSF受容体α、MGFP、モンスター緑色蛍光タンパク質、BmNPVpol5' - UTR、 カイコ核多角体病ウイルス多角体の5' -非翻訳領域配列; SV40ポリA、SV40ポリAシグナル配列、P 3xP3、3xP3プロモーター、P SER1、SER1プ ​​ロモーター; fibLポリA、フィブロインL鎖ポリAシグナル配列、HR3、 カイコ核多角体病ウイルスHR3エンハンサー。 <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2無細胞アッセイ系のスキーム。 A）カイコで生産さsGMRαを用いた競合結合アッセイは。 B）中和と非中和抗体の効果は、無細胞系による結合阻害について。 C）様々な中和抗体の濃度と非中和抗体との間の結合阻害の差は。 GM - CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、sGMRα、水溶性のGM - CSF受容体α、彼の、RGS - Hisタグ、AP、アルカリホスファターゼ。 <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。GM - CSFモノクローナル抗体または自己免疫PAP患者からの血清IgG画分の影響によりsGMRαにGM - CSF結合阻害。 GM - CSF自己抗体による結合阻害や増殖阻害との間のA）の関係。 B）GM - CSF自己抗体の種々の濃度の結合阻害。血清IgG画分19重量％の結合阻害と％の成長阻害のIC 50との間のC）の関係。 IC 50、50％阻害濃度、GM - CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子。 <table border="1"><tbody><tr><td>サンプル</td><td> A </td><td> B </td><td> C </td></tr><tr><td colspan="4">アッセイ間</td></tr><tr><td> ＃決定の</td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td>平均値（％結合阻害） </td><td> 61.6 </td><td> 63.8 </td><td> 69.7 </td></tr><tr><td>平均値（％増殖阻害） </td><td> 21.0 </td><td> 73.4 </td><td> 82.8 </td></tr><tr><td>変動係数（％）（％結合阻害） </td><td> 6.0 </td><td> 5.6 </td><td> 8.3 </td></tr><tr><td>変動係数（％）（％増殖阻害） </td><td> 64.4 </td><td> 18.3 </td><td> 10.4 </td></tr></tbody></table>両方のアッセイは、5 ng / mlのGM - CSFのとGM - CSF自己抗体と同等の濃度で行った。 表1 3つの独立した実験で得られたパーセントの結合と成長の阻害との間の変動係数の比較。

<ol><li>Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neutralizing+capacity+of+GM-CSF+reflects+disease+severity+in+a+patient+with+pulmonary+alveolar+proteinosis+successfully+treated+with+inhaled+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF.</a> Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).</li>
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<li>Sakagami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+GM-CSF+autoantibodies+and+reproduction+of+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis.</a> N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).</li>
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<li>Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis+as+an+autoimmune+disease+with+neutralizing+antibody+against+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 190, 875-880 (1999).</li>
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<li>Urano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+assay+to+estimate+the+neutralizing+capacity+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies.</a> J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).</li>
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</ol>

無細胞アッセイは、優れた再現性と速さとGM - CSF自己抗体の中和能を推定する。 GM - CSF自己抗体または患者の血清IgG分画による結合阻害は、このアッセイにより評価した。データは、無細胞アッセイの結合阻害とそれぞれTF - 1細胞​​を用いてバイオアッセイの増殖阻害との間の相関を示した。バイオアッセイは、広く利用され、しかし別の施設と我々はこの新しいシステムを使用することによって避けるこ​​とができる様々な時点、の間でデータを比較することの難しさを抱いている。 GM - CSFは、低親和性でsGMRαと結合し、バイナリ複雑な20を形成する。最近の研究では、ヒトGM - CSFはGM - CSF受容体αと細胞表面21上の高親和性を持つdodecameric複合体を形成するGM - CSF受容体βに結合することを示した。このように、単量体GM - CSF受容体αと二量体のGM - CSF受容体βから成る三元錯体に基づくアッセイ系は、無細胞アッセイを向上させるために、将来の候補となるシステムになります。

組換え可溶性gm - csf受容体を用いてgm - csf抗体の中和能を推定する無細胞アッセイシステム

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

背景：これまで、我々はその中和能を示したが、GM - CSF自己抗体の濃度は、自己免疫性肺肺胞タンパク症（PAP）1-3患者の疾患の重症度と相関していたではない。肺におけるGM - CSFの生物活性の廃止は、4,5自己免疫PAPの可能性が高い原因であるとして、それはPAPと各患者の病気の重症度を評価するためのGM - CSF自己抗体の中和能を測定するために期待される。 今までは、GM - CSF自己抗体の中和能は、ヒト骨髄細胞またはGM - CSF 6月8日で刺激TF - 1細胞の増殖阻害を評価することによって評価されている。バイオアッセイ系では、しかしながら、一定の条件で細胞を維持するための技術的な問題に起因する別の研究室からのデータを、比較するだけでなく、信頼性の高いデータを得るためにしばしば問題になります。 目的：無細胞受容体結合アッセイを用いて細胞表面にGM - CSF受容体に結合するGM - CSFを模倣する。 方法：トランスジェニックカイコ技術は、高純度9月13日に組換え可溶性GM - CSF受容体α（sGMRα）のための大規模な量を得るために適用した。組換えsGMRαは、絹のタンパク質に融合されることなく、絹の糸の親水性のセリシン層に含まれていた、従って、我々は容易に中性の水溶液14,15との良好な純度で繭から抽出することができます。幸いなことに、GM - CSFとの結合に不可欠なオリゴ糖の構造は、他の昆虫や酵母によって生成されるものよりも人間のsGMRαの構造に、より類似しています。 結果：無細胞アッセイ系sGMRαを使用しては高い可塑性と信頼性でデータが得られた。 sGMRαにGM - CSF結合を用量依存sGMRαを使って、新しい無細胞アッセイ系は、中和活性の測定のためのより有用であることを示す、TF - 1細胞​​を用いたバイオアッセイと同様の方法でポリクローナルGM - CSF自己抗体によって阻害されたTF - 1細胞​​またはヒト骨髄細胞を用いたバイオアッセイ系よりGM - CSF自己抗体の。 結論：我々はGM - CSF自己抗体の中和能を定量化する無細胞アッセイを確立した。

我々は、受容体への顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM - CSF）の結合を推定するために、無細胞受容体結合アッセイをデザインしました。それは、優れた再現性とGM - CSF自己抗体による可溶性GM - CSF受容体αに結合するビオチン化GM - CSFの競合的阻害を評価することを可能にします。

組換え可溶性GM - CSF受容体を用いてGM - CSF抗体の中和能を推定する無細胞アッセイシステム

背景：以前、我々はGM-CSF自己抗体の濃度ではなく、中和能が疾患と相関することを実証した...

この実験の全体的な目的は、G-M-C-S-F自己抗体の中和能を定量化するセルフリーアッセイを確立することです。まず、トランスジェニックカイコを作製します。ヒトSGMR alpha遺伝子を導入してリコンビナントSGMR alphaを産生させ、次いでbioTEを用いてリコンビナントヒトG-M-C-S-Fを標識します。次に、GM-CSFオートアンチボディによるSGMR alphaへのGM-CSF結合の阻害研究を用いて、無細胞システムと通常のバイオアッセイとの相関性を評価します。得られた結果は、血清IgG画分および精製GM-CSFオートアンチボディによる、バイオアッセイでの増殖抑制と無細胞システムでの結合抑制との間に有意な相関があることを示しています。TF-oneバイオアッセイのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、GM-CSFオートアンチボディの中和能を測定する上で、再現性の高い高度な解析が可能であることです。GM-CSF自己抗体は自己免疫性原発性疾患の予後に影響を及ぼすため、本手法の意義は診断分野まで広がります。また、BEGFやTNFAの受容体などの組換えサイトカイン受容体を用いた競合的結合アッセイにも適用可能です。本手順の実演は、私の研究室の博士課程学生であるanoが行います。彼は、このpHフリーシステムの開発者です。このビデオでは、リコンビナントSGMR alphaの製造に使用されるカイコについて説明します。最初のステップは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてヒト胎盤cDNAライブラリーからSGMR AlphaのcDNAを増幅し、PCRアンプリコンを得ることです。次に、2回目のPCRを行い、5'末端にULAウイルスのポリヘドリン由来の50塩基の5' UTR配列を付加します。R RRGsにタグを付けるには、そのタグを3'末端に付加し、増幅したPCR産物をプラスミドP MSG one one mgにクローニングします。構築物PS GMR slash M1 one mgをヘルパーベクターPHA three pigと共に、カイコPNDW one系統の卵に共注入します。孵化したG0幼虫を25 °Cで蛾まで飼育します。その後、兄弟間での交配、またはPNDW oneとの交配によりG1胚をスクリーニングし、眼におけるMG FPの発現によって、形質転換カイコの保持を確認します。SGMR alpha遺伝子を用い、500 millimolar 塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を用いて遺伝子組換えカイコ繭から組換えSGMR alphaを抽出し、4 °Cで24時間撹拌します。サンプルを20,000 gで15分間遠心分離します。沈殿物を除去するため、上清をニッケル親和性カラムに適用します。10 millimolarから250 millimolarまでの線形勾配でカラムを洗浄し、タンパク質を溶出させます。精製されたSGMR alphaを含む画分を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で透析します。まず、サンプルをPBSで透析してください。G-M-C-S-F調製物からソルビトールを除去するため、20 millimolarの冷たいメタ sodium date溶液を1 milliliter加え、サンプルを氷上、暗所にて30分間インキュベートします。次に、最終濃度が15 millimolarになるようにグリセロールを添加し、100 millimolarの酢酸ナトリウム緩衝液に対して透析を行います。続いて、最終濃度が5 millimolarになるようにビオチンアジドを溶液に加え、室温で2時間混合します。最後に、PBSで透析して非反応性物質を除去し、マイクロタイタープレートに50 µLのモノクローナル抗polyhis抗体を加え、4°Cで一晩コートします。PBSTで5回洗浄します。その後、100 µLのブロッキング溶液を加え、4°Cで3時間インキュベートします。再びPBSTで5回洗浄します。PBSTで5回洗浄した後、ブロッキング溶液に50 µLのSGMR alphaを加え、4 °Cで一晩インキュベートします。GM-CSF自己抗体を含むサンプル25 µLを加え、次にビオチン化GM-CSF 25 µLを加えて、4 °Cで1時間インキュベートします。SGMR α G-M-C-S-F複合体を形成させます。PBSTで5回洗浄を続け、その後、ビオチン化されたG-M-C-S-Fと結合したSGMR αを検出するため、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン 50 µLを加え、4 °Cで1時間置きます。PBSTで5回洗浄し、化学発光基質 50 µLを溶液に加えます。室温で1時間インキュベートし、プレートリーダーを用いて化学発光活性を測定します。SDS-PAGE解析において、カイコ由来の組換えSGMR αは、非還元条件下では単量体および二量体の両方の形態で存在しますが、還元条件下では単量体のみで存在します。SGMR alphaのモノマーおよびジスルフィド結合ダイマーのこのリコンビナント混合物は、競合結合アッセイにおいて機能します。ビオチン化G-M-C-S-FとSGMR alphaの複合体は特異性を示し、さまざまな濃度の中和抗体を添加することで解離しますが、非中和抗体では解離しません。さらに、G-M-C-S-F中和抗体の濃度を上げると、用量依存的に結合阻害率の上昇と正の相関を示します。予想通り、G-M-C-S-F非中和抗体による結合抑制は用量依存性を示しませんでした。このセルフリーシステムにおいて、G-M-C-S-F自己抗体によるSGMR alphaへのG-M-C-S-F結合抑制は、r = 0.988、P値 = 0.002という計算値で密接な相関を示すことが実証されました。G-M-C-S-F自己抗体による結合抑制は、用量依存的に増加しました。同様に、結合阻害は、インポートの増殖阻害と有意に相関していました。本アッセイは、結合阻害率のIC 50と血清IgG画分による増殖阻害率との関係によってここに示されたように、自己免疫性PAP患者の血清IgG画分の有用性および分析に役立ちます。さらに、実験間の変動係数は、細胞フリーシステムが増殖阻害バイオアッセイよりも優れていることを示しています。一度習得すれば、この無細胞GM GSF受容体リガンド結合アッセイは38時間で完了させることができます。反応温度とインキュベーション時間を維持することが重要です。この手法は、従来のバイオアッセイに代わり、新規抗体医薬の生物活性をスクリーニングする研究者にとって道を開くものとなりました。

a-cell-free-assay-system-estimating-neutralizing-capacity-gm-csf

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学ぶGM-CSF抗体の中和能を無細胞アッセイで定量化する方法。組換え可溶性受容体を用いて結合阻害を評価し、従来のバイオアッセイと高い相関性を示す再現性のある測定システムを確立します。

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