組換え可溶性GM - CSF受容体を用いてGM - CSF抗体の中和能を推定する無細胞アッセイシステム

この実験の全体的な目的は、G-M-C-S-F自己抗体の中和能を定量化する無細胞アッセイを確立することです。まず、トランスジェニックカイコを作製します。ヒトSGMR alpha遺伝子を導入してリコンビナントSGMR alphaを産生させ、続いてbioTEを用いてリコンビナントヒトG-M-C-S-Fの標識を行います。

次に、GM-CSF自己抗体によるSGMRαへのGM-CSF結合の阻害に関する研究を用いて、無細胞系と通常のバイオアッセイとの相関性を評価します。得られた結果は、血清IgG分画および精製GM-CSF自己抗体によるバイオアッセイの増殖抑制と、無細胞系の結合抑制との間に有意な相関があることを示しています。TF-oneバイオアッセイのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、GM-CSF自己抗体の中和能を測定するための、再現性の高い高精度な分析システムである点にあります。

GM-CSF自己抗体が自己免疫性原発性疾患の全体的な予後に影響を与えるため、本手法の意義は診断へと広がります。また、BEGF受容体やTNFA受容体などのリコンビナントサイトカイン受容体を用いた競合的結合アッセイにも適用可能です。手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程学生であるanoが行います。彼は、このpHフリーシステムの開発者です。

このビデオでは、組換えSGMR alphaの生産に使用される家蚕について説明します。最初のステップは、ヒト胎盤cDNAライブラリーから、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてSGMR alphaのcDNAを増幅し、PCRアンプリコンを得ることです。次に、2回目のPCRを行い、5'末端にULAウイルスのポリヘドロン由来の50塩基の5' UTR配列を付加します。

R RRGsにタグを付けるため、そのタグを3'末端に付加し、増幅したPCR産物をプラスミドP MSG one one mgにクローニングします。構築物PS GMR slash M1 one mgをヘルパーベクターPHA three pigと共に、カイコPNDW one系統の卵に共注入します。孵化したG zero幼虫を25 °Cで蛾まで飼育します。その後、兄弟間での交配、またはPNDW oneとの交配によりG one胚をスクリーニングし、眼におけるMG FPの発現によって、組換えカイコの有無を判定します。

SGMR alpha遺伝子を用いて、500 millimolar 塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液から形質転換カイコの繭より組換えSGMR alphaを抽出し、4 °Cで24時間撹拌します。サンプルを20,000 ×gで15分間遠心分離します。沈殿物を取り除くため、上清をニッケルアフィニティカラムに適用します。

10 millimolarから250 millimolarまでの線形勾配を用いて、カラムの洗浄およびタンパク質の溶出を行います。精製されたSGMR alphaを含む分画を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で透析します。まず、サンプルをPBSで透析してください。

G-M-C-S-F調製物からソルビトールを除去するために、20 millimolarの冷えたメタホスホン酸ナトリウム溶液を1 mL加え、サンプルを氷上の暗所で30分間インキュベートします。次に、最終濃度が15 millimolarとなるようにグリセロールを加え、100 millimolar酢酸ナトリウム緩衝液に対して透析を行います。続いて、最終濃度が5 millimolarとなるようにビオチンアジドを溶液に加え、室温で2時間混合します。

最後に、PBSで透析して非反応性物質を除去し、マイクロタイタープレートを50 µLのモノクローナル抗polyhis抗体でコーティングし、4 °Cで一晩置きます。PBSTで5回洗浄します。その後、100 µLのブロッキング溶液を加え、4 °Cで3時間インキュベートします。

再び、PBSTで5回洗浄します。PBSTで5回洗浄した後、ブロッキング溶液に50 µLのSGMR alphaを加え、4 °Cで一晩インキュベートします。GM-CSF自己抗体を含むサンプル25 µLを加え、続いてビオチン化GM-CSF 25 µLを加え、4 °Cで1時間インキュベートします。

SGMR alpha G-M-C-S-F複合体を形成させるため、PBSTで5回洗浄し、次いでアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを50 µL添加し、4 °Cで1時間反応させて、ビオチン化G-M-C-S-Fが結合したSGMR alphaを検出します。PBSTで5回洗浄した後、化学発光基質を50 µL添加し、室温で1時間インキュベートして、プレートリーダーを用いて化学発光活性を測定します。SDS-PAGE解析において、カイコ由来のリコンビナントSDMR alphaは、非還元条件下ではモノマーおよびダイマー（DME）形式の両方で存在しますが、還元条件下ではモノマー形式のみで存在します。

SGMR alphaのモノマーとジスルフィド結合ダイマーからなるこの組換え混合物は、競合結合アッセイにおいて機能します。ビオチン化G-M-C-S-FとSGMR alphaの複合体は特異性を示し、さまざまな濃度の中和抗体を添加することで解離しますが、非中和抗体では解離しません。さらに、G-M-C-S-F中和抗体の濃度を上げると、用量依存的に結合阻害率の上昇と正の相関を示します。

予想通り、GM-CSF非中和抗体による結合阻害は用量依存性を示しませんでした。このセルフリーシステムでは、GM-CSF自己抗体によるSGMRαへのGM-CSF結合の阻害について、算出値 r = 0.988、P値 0.002という高い相関性が示されました。GM-CSF自己抗体による結合阻害は、用量依存的に増加しました。

同様に、結合阻害はインポートの増殖抑制と有意に相関していました。このアッセイは、本研究で示した結合阻害率のIC 50と血清IgG分画による増殖抑制率との関係からわかるように、自己免疫性PAP患者の血清IgG分画の有用性および解析に利用可能です。さらに、実験間の変動係数は、増殖抑制バイオアッセイよりもセルフリーシステムの方が優れていることを示しています。

習得すれば、このセルフリーGM GSF受容体リガンド結合アッセイは38時間で完了させることができます。反応温度とインキュベーション時間を維持することが重要です。この手法は、従来のバイオアッセイに代わり、新規抗体医薬の生物学的活性をスクリーニングする研究者に道を開きました。