Name: シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶ齧歯類脳スライスからのバイブロ解離法による神経細胞単離技術。シナプス前終末を保持した生細胞を用いて、シナプス伝達とイメージングを詳細に研究できます。

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我々は、博士に感謝します。書かれた原稿の書式設定の支援のための初期の技術の集合まで、および博士ヴェロニカアルバレス中に彼らの援助のためのping Jun朱と進小山。この研究は、NIAAAの学内臨床と医学研究の部門によって資金を供給された。

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

成功vibrodissociationはスライスが健康な神経細胞が含まれているし、間質の神経細胞が毒性損傷を与えることなくスライスを終了するのに十分な柔軟性であることが必要です。健全なスライスが成人の脳スライスで発見されているよりも少ないグリア/ interstiatial材料で作ることができるとき、したがって、技術は、出生後早期年齢（P1 - 21）で最適に動作します。我々の経験では、しかし、スライス自体のニューロンの生存のためのスライス標本を最適化することvibrodissociation技術のための逆効果かもしれません。我々は日常的にショ糖がvibrodissociationのために準備+、スライスが私たちの通常記録のACSFで（例えばカット）を調製することができる細胞外のNa +とCa 2の多くのために置換されたコールド変更したACSFを使用してその場の記録でのスライスを用意するのに対し。スライス自体の個々のニューロンからの記録のためにスライスを作成するときに我々はまた、Cだけのセクショニング後に35℃で通常のACSFでスライスを配置し、室温に戻す前に、この温度で​​30〜60分間のためにそれらを残す。しかし、vibrodissociationのために準備のスライスは、単にスライスした後、室温に即座に移動されます。これらの手順は、ニューロンがより容易にスライス自体から緩い動揺することができる会社間質組織の不足のため、おそらくvibrodissociation後の健康なニューロン、高収率を提供しています。我々が日常的に特定の日に私たちの記録とイメージング実験のための十分な神経細胞を得ることとして我々は徹底的に、スライスの調製条件を検討していない。それは、スライス厚やpreinc​​ubatonの手続きの変更などの追加修正は、、健康な神経細胞の収率を高めるために行われる可能性があります。非常に軽度のプロテアーゼ処理は、セルの歩留まりを向上させ、高齢動物で動作するように技術を得るための努力で試みられている。しかし、いつもにも軽度のプロテアーゼ処理は、シナプスの機能を混乱させるようだ。このように、間にプロテアーゼおよび機械的解離の組み合わせは、まだそれが日付に前脳ニューロンの信頼性が実証されていない動作するように見つけることができる。 それはvibrodissociation後の健康な神経細胞の比較的低い収率はテクニックが豊富な神経細胞サブタイプ、主に投射ニューロンを研究するために主に有用であることを意味するにも留意すべきである。小さな神経細胞サブポピュレーションを容易に識別可能なGFP発現マウスの可用性は、これらのまれな神経細胞を研究の可能性が高まります。神経細胞の収率が大幅に向上させることができる場合を除きしかし、これらのニューロン上のデータの蓄積が相対的に遅くなる可能性があります。 いくつかのステップは、カルシウム感知染料による神経細胞のロードが成功のために不可欠であることが証明されている。 AM -エステル化された色素への暴露は、37 ° Cで行われ、そして我々はより低い温度で色素負荷しようとするに成功していない。染料の濃度は、それが色素ローディングのそれより高い濃度がシナプス前boutonsでカルシウム濃度を低下させる表示されるので、ロード時間と温度の両方を考慮して最適化する必要があります。我々はより高い濃度でロードすると、周波数とsIPSCsの振幅を減少させることを観察した。小さなシナプス前boutonsの緩衝能力は相馬では異なる可能性があるとboutonsのサイズが一致していないので、カルシウム感知vibrodissociatedニューロンのシナプス前終末に染料をロードする場合、注意が必要です。ニューロンを含む料理は、​​色素ローディング、以下のHEPES緩衝外部溶液で洗浄し、洗浄後の回復時間が非常に重要ですしている。さらに、細胞全体の記録のための良好なシールを作るために、細胞は、外側の細胞膜からの非内部化色素分子を取り除くために徹底的に洗浄する必要があります。 電気生理学および生細胞イメージングのためのvibrodissociated神経細胞の使用に加えて、免疫細胞化学的手法はこれらの細胞11,12に適用することもできます。細胞は容易に固定し、抗体の多様、および他の細胞のマーカーで染色することができます。これらの細胞の使用は、GABA作動性シナプス前終末でのタンパク質発現の可視化のためのクリーンな準備を提供します。 GABA作動性ニューロンに特異的プロモーターの制御下に蛍光タンパク質を発現するマウスを使用すると、捜査官がvibrodissociated準備（図1）で個々のシナプス端末を識別することができます。このタイプのイメージング蛍光マーカーは、レーザーベースの顕微鏡とSTEDのような新しいテクニック（刺激の排出枯渇顕微鏡）を用いて端末の形態学的測定を可能にすることができる。シナプス小胞サイクリングを報告する色素で可視化は、この準備でも可能です。赤池らは、生きた細胞4の端子を視覚化するスチリル色素、FM1 - 43でGABA作動端子ラベルを貼っている。 またvibrodissociatedでプロファイルRNA発現する単一セルの逆転写酵素PCRを行うことができるはずですニューロン。このテクニックは、日常的に細胞培養で増殖させた酵素的に解離ニューロンとニューロンに適用されます。

<table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td>振動組織スライサー</td><td>ライカマイクロシステムズ株式会社</td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td>細胞培養用ディッシュ（35 mm）に</td><td> BDファルコン</td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスボトムディッシュ</td><td> Willco皿</td><td> GWSB - 5040またはGWSB - 3522 </td><td>イメージングのための0.16〜0.19ミリメートルのガラスの厚さ</td></tr><tr><td>圧電マニピュレータ</td><td> EXFO -バーレイ</td><td> LSS - 3000 </td><td>また、リレーなどを使用することができます</td></tr><tr><td> SD9スクエアパルス刺激</td><td>グラステクノロジー</td><td> SD9K </td><td>圧電マニピュレータをトリガするための</td></tr><tr><td>解剖ステレオスコープ</td><td>ワイルドHeerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td>また、任意のステレオスコープを使用することができます</td></tr><tr><td> /ブラウンマイクロピペットプラーフレイミング</td><td>サターのインストゥルメント</td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td>薄い壁ガラス管</td><td>世界の精密機器</td><td> TW - 150F - 4 </td><td>火炎密封したガラスマイクロピペットとパッチマイクロピペット用</td></tr><tr><td> 6チャンネルの潅流バルブコントロールシステム</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> VC - 6またはVC - 6M </td><td></td></tr><tr><td>灌流ファーストステップ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> SF - 77B </td><td></td></tr><tr><td> 20 - 63x目標と倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCDカメラ</td><td>アンドールテクノロジー</td><td> IXON EM + DU - 888 </td><td></td></tr><tr><td>エキサイト蛍光照明光源</td><td> EXFOフォトニクスソリューション（株） </td><td> X - Citeの120PC </td><td></td></tr><tr><td>カルシウム指示薬回答にみたFluo - 4、 </td><td>分子プローブ</td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のvibrodissociation

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

中枢神経系から神経細胞の機械的な解離は、シナプス前boutonsは関心の分離されたニューロンに接続されたままという利点があります。これは細胞外とシナプス後細胞内環境を良好に制御することができる条件下でのシナプス伝達の検査が可能になります。 vibrodissociationとして知られているプロテアーゼの使用せずに振動ベースの技術は、機械的な分離のための最も人気のあるテクニックです。小さなボール状にファイアーポリッシュ先端とマイクロピペットは、P1 - P21齧歯類から作られる脳のスライスに置かれます。マイクロピペットは、スライス面に平行に振動し、分離されたニューロンの解放をもたらすスライスの厚さによって低下する。分離されたニューロンはvibrodissociationの数分以内に研究のための準備が整いました。細胞外環境の優れた制御隣接セルの影響から自由;適合電気生理学とイメージングの研究に適した実行可能な、比較的成熟した神経細胞の急速な生産：このテクニックは、などの一次ニューロン培養、脳スライスと酵素的に分離された神経細胞の使用上の利点があります。迅速な薬剤のアプリケーションおよび総細胞灌流を用いて十分に制御された薬理学的実験のため、およびスライスまたは細胞培養調製物中の神経細胞への相対的な細胞全体のレコーディングにおける空間クランプ改良。この製剤は、シナプス生理学、薬理学、変調と可塑性を調べるために使用することができます。生きている細胞とboutonsでプリとシナプス後要素の両方のリアルタイムイメージングは​​vibrodissociatedニューロンを用いても可能です。プリとシナプス後要素の分子成分のキャラクタリゼーションは、免疫学とイメージングベースのアプローチで達成することができる。

この報告書は、添付されたシナプス前boutonsを保持する個々の実行可能な神経細胞の機械的な分離のためのテクニックを示しています。 Vibrodissociatedニューロンは、隣接セルからの影響のない急速な生産、優れた薬理学的制御と空間のクランプの改善の利点を持っている。このメソッドは、シナプスの要素のイメージングやパッ​​チクランプ記録に使用することができます。

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

中枢神経系からのニューロンの機械的解離には、シナプス前ボタンが単離されたニューロンに付着したままであるという利点があり、...

本実験の目的は、薬理学的制御を可能にし、スペースクランプの精度を高めると同時に、隣接細胞の影響を排除できる、切断されたシナプスバトンを付着させたままのニューロンを単離することです。これは、まず生後1日から21日（P1〜P21）のラットまたはマウスから目的の脳領域を含む急性脳切片を作製し、次いで個々のニューロンを単離することで達成されます。急性切片をディッシュに配置し、火炎封止したガラス製マイクロピペットを目的の領域内で振動させながら切片内を移動させることで、個々のニューロンを遊離させます。ニューロンをディッシュの底面に接着させます。次に、線維解離させたニューロンを含むディッシュを顕微鏡へと移し、シナプス生理学、薬理学、変調、可塑性を検討します。さらに、生細胞におけるプレシナプスおよびポストシナプス要素のリアルタイムイメージングと特性評価を行い、密なシールを用いたホールセル記録および蛍光顕微鏡法を通じて、シナプス応答の生理学的・薬理学的特性と、それに伴うプレシナプス末端機能の変化に関する結果を得ます。脳切片、培養ニューロン、または酵素的に解離させたニューロンからの記録といった既存の手法に対する本手法の主な利点は、接着した強固なシナプス結合によりプレシナプス要素の制御と可視化が可能である一方で、ポストシナプス構造が比較的コンパクトであるため、ボルテージクランプの改善と細胞外環境の優れた制御が実現できる点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、健康なニューロンを得るための収率が、動物の年齢、振動パラメータ、スライス内の関心領域などのいくつかの条件によって劇的に変動するため、習得に苦労します。また、細胞記録の持続時間が従来の切片記録よりも短くなる場合があります。VI解離ステップでは、スライス内を移動する距離や深さを正確に記述することが困難であるため、この手法を視覚的に実演することが極めて重要です。脳スライスを作成する準備として、人工脳脊髄液（aCSF）をカーボゲンで15分間バブリングして準備します。次に、2 mMの塩化カルシウムと1 mMの塩化マグネシウムを加えます。生後1日から21日の動物を麻酔して断頭した後、脳を取り出し、目的の領域が含まれるように所望の方向で切断します。切断した脳をステージに固定し、A CSFを満たしたチャンバーに浸します。次に、チャンバーをブレインスライサーに取り付け、振動刃を用いて、1枚あたり250〜400 µmの厚さで脳を切片化します。切片を人工脳脊髄液（A CSF）に入れ、プリインキュベーションチャンバー内でカルボゲンをバブリングさせながら、少なくとも1時間静置します。火炎封止ガラスマイクロピペットを準備するために、まずFlaming Brownまたは同等のマイクロピペットプラーを用いて、チップ径2 µmの標準的なパッチクランプ用マイクロピペットを作成します。マイクロピペットチップをブンゼンバーナーの炎に約2秒間かざし、直径200〜300 µmの溶融球を形成させます。次に、炎で密封したパッチピペットを、圧電バイモルフリレーまたは同等の効果を持つ装置を用いて、100〜200 µmの移動距離で左右に高速振動させることができるマイクロマニピュレーターのホルダーに取り付けます。HEPES緩衝生理食塩水を調製します。水酸化ナトリウムを用いて溶液をpH 7.4に調整し、スクロースを用いて浸透圧を約300 milli osmolesに調整します。次に、直径35ミリメートルの培養皿にHEPES緩衝生理食塩水を満たします。切片を培養皿に入れ、曲げワイヤーを用いて解剖用実体顕微鏡で250倍の倍率で観察します。細胞を解離させるため、スライスをディッシュの底に固定します。火炎封止マイクロピペットの先端をスライス表面に配置します。マイクロマニピュレーターを作動させ、先端を10〜30 hertzの周波数、約100 micrometersの振幅で横方向に振動させます。マイクロマニピュレーターを用いて、マイクロピペットのチップをスライス内に導入し、30秒以内に全層を貫通するように切り込みを入れます。単離されるニューロンの数を最大化するために、必要に応じてこの手順を繰り返します。次に、チップをスライスから取り出します。ピンセットでスライスを拾い上げ、溶液の中で静かに振ります。その後、スライスを溶液から完全に取り出します。細胞がディッシュの底に沈殿するまで、少なくとも10分間待ちます。ニューロンを含むディッシュを倒立顕微鏡のステージ上に置き、1倍から63倍の対物レンズで観察します。膜に水疱（blabbing）がなく滑らかで、核が検出可能でありながら過大ではないニューロンを探します。位相差光学系を使用する場合は、黄色味を帯びており、青すぎない位相明視野のニューロンを探します。Flaming Brownまたは同等のピペッターを用い、ピペットチップの抵抗値が2～4 MΩになるように標準的なパッチマイクロピペットを作製します。シナプス応答を測定する場合はセシウムクロリドベースの細胞内液を、固有の膜特性および活動電位を測定する場合は塩化カリウムベースの細胞内液をパッチピペットに充填します。標準的な電気生理学的手法を用いて、ニューロンに対してホールセルパッチクランプ法を実施します。まず、ギャップフリーのデータ収集プロトコルを用いて、自発的なポストシナプス電流を記録します。次に、細胞外液の分子組成を変化させるため、200 nMの動物毒素またはテトロドトキシン、あるいは低カルシウム含有の細胞外液を適用し、ミニチュアポストシナプス電流を記録します。目的の薬剤は、融合させた正方形の先端を持つガラス管のバレルの一つに個別に充填され、この管を目的のニューロンの近くに配置します。ステッパーモーター駆動のマイクロマニピュレーターにより、個々のバレルをニューロンに提示させ、側方に移動させることで10〜100ミリ秒で溶液交換を行います。ダウンロードしたbnsを、カメラベースまたはマルチフォトンの顕微鏡を用い、高開口数対物レンズで高倍率に観察してください。ここでは、電子増倍型電荷結合素子（EMCCD）カメラで撮影したニューロンとbnsの画像を示します。電位クランプ記録中、励起光光源の出力は、ND 1.0フィルターおよび12%出力に調整したアイリスフィルターを用いて1.2%まで減衰させました。塩化セシウムベースの細胞内液を用いることで、自発的なシナプス電流が観察され、小胞融合を可視化できます。シナプス前バトンにおいては、THプロモーターの制御下でシナプスフロリン構築物を発現しているマウスを使用しました。Synaptic florinは、pH感受性が強化されたGFP変異体であるecliptic Florinを、小胞融合時に小胞結合膜タンパク質に連結させた分子構築物です。このモチーフは、より中性に近い細胞外環境にさらされることで、小胞およびシナプス前末端に対応する点状構造（puncta）において蛍光強度が上昇します。これらのマウスから海馬ニューロンを繊維解離させることで、GABA作動性末端に想定されるサイズと位置にある蛍光点状構造を可視化することができ、本手順ではこの操作を試みます。健康なニューロンを得るためには、健康なスライスを確実に作製することが重要であることを忘れてはいけません。したがって、急性脳スライスの作製はこの手順に従う上で重要なステップとなります。シナプス前終末やポストシナプスニューロンでどのようなタンパク質やmRNA種が発現しているかなど、追加の疑問を解決するために、免疫組織化学染色やシングルセルRT-PCRなどの他の手法を行うことができます。このビデオを視聴することで、健康な単離ニューロンを抽出し、それを電気生理学的な解析およびリアルタイムイメージングに活用する方法について深く理解することができます。

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、齧歯類と異なる年齢のヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃の使用を示します。この特定のケースでは、我々は、成体マウス（3-6ヶ月齢）と成人cynomologusサル（9-15歳）を使用します。もともと博士リヒトマン（ガンの研究室で記述されたこの技術、...

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

このビデオでは、マウスの脳スライスにおけるレチノゲン酸シナプスとコルチコゲン酸シナプスの電気生理学的記録について説明しています。背側外側膝状核(dLGN)を含むスライスは、記録チャンバーに入れられます。刺激ピペットは、網膜神経節細胞(RGC)を刺激して網膜性シナプスを調査するための視路または皮質ニューロンを刺激して皮質性シナプスを調査するための視床網核のいずれかに配置されます。刺激を受けると、RGCと皮質ニューロンは興奮性神経伝達物質を放出し、LGNリレーニューロンにシナプス電流を生成します。これらの電流は、パッチクランプ記録ピペットを使用して記録されます。...

マウス脳切片における網膜形成型および皮質形成型シナプスの電気生理学的研究

このビデオは、内側前頭前野(mPFC)軸索を光遺伝学的に刺激し、LECの錐体ニューロンの応答を記録することにより、外側嗅内皮質(LEC)のシナプス効率を研究する手順を示しています。この方法は、パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、シナプスの可塑性を研究するものです。...

ラット脳切片におけるシナプスイベントの光遺伝学的刺激と電気生理学的記録

出典:McLeod, F., et al.海馬のげっ歯類の脳スライスにおけるシナプス密度の評価。J. Vis. Exp.

免疫蛍光法を用いたマウス海馬切片のシナプスの顕微鏡解析

シナプス前放出面膜でのCa2+電流の記録は、Ca2+の侵入と神経伝達物質の放出を正確に理解するための鍵となります。ヤツメウナギの脊髄の急性解離を示し、機能的な孤立した細網脊髄軸索を生成し、個々のシナプス前末端の放出面膜から直接記録できるようにします。...

ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

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急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

ここでは、横性属核を含む急性脳スライスの調製のためのプロトコルと、網膜原生殖器およびコルチコゲニキュレートシナプス機能の電気生理学的調査を行う。このプロトコルは、同じ急性脳スライスの高放出および低放出確率でシナプスを研究する効率的な方法を提供します。...

網膜原生殖器およびコルチコゲン化シナプス機能の電気生理学的調査

我々は、新生ラット脳組織を処理して、神経終末におけるシナプス小胞分布の morphometric...

Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析

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エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

学ぶ齧歯類脳スライスからのバイブロ解離法による神経細胞単離技術。シナプス前終末を保持した生細胞を用いて、シナプス伝達とイメージングを詳細に研究できます。

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

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