シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

次の実験の全体的な目標は、シナプスバトンにつままれた付着したニューロンを分離することで、隣接する細胞の影響を排除しながら、薬理学的制御と改善されたスペースクランプを可能にすることです。これは、出生後P 1からP 21までのラットまたはマウスの急性脳スライスを調製し、第2のステップとして個々のニューロンを単離するための関心のある脳領域を含むことによって達成されます。急性スライスを皿に入れ、炎封されたガラスマイクロピペットを対象領域内で振動させながら、チップをスライス内で移動させ、個々のニューロンを解放する。

ニューロンは、皿の底に付着する時間が与えられます。次に、線維解離ニューロンを含む皿を顕微鏡に移し、シナプス生理学、薬理学、調節、可塑性を調べるために、生細胞内のシナプス前およびシナプス後の要素のリアルタイムのイメージングと特性評価の結果が得られ、シナプス応答の生理学的および薬理学的特性とそれに伴うシナプス前終末機能の関連変化をタイトシールを通じて示します。 全細胞記録および蛍光顕微鏡法。この技術の主な利点は、脳スライス、培養ニューロン、酵素解離ニューロンからの記録などの既存の方法よりも優れている点は、取り付けられたピンチタフなシナプスbnsがシナプス前要素の制御と可視化を可能にし、比較的コンパクトなシナプス後構造により、電圧クランプの改善と細胞外環境の優れた制御が可能になることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、健康な神経を得るための収量が、動物の年齢、振動パラメータ、スライスの関心領域など、いくつかの条件によって劇的に異なる可能性があるため、苦労するでしょう。また、細胞の記録が保持される個々の人は、従来のスライドよりも短い時間で持続します。録音。VI解離ステップは、スライスを介して移動距離と不一致を正確に記述することが困難であるため、学習が困難であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要ですI脳スライスを作成するための準備として、カルボゲンを含む人工脳脊髄液バブルCSFを15分間準備します。

次に、2ミリモルの塩化カルシウムと1ミリモルの塩化マグネシウムをそれに加えます。出生後1〜21歳のPの動物を麻酔して斬首した後、脳を取り出し、次に関心のある領域を含むように希望の向きに切断します。解剖した脳をステージに固定し、CSFで満たされたチャンバーに沈めます。

次に、チャンバーをブレインスライサーに取り付け、振動ブレードでスライスあたり250〜400マイクロメートルの厚さで脳を切片にします。A CSFをスライスし、カルボゲンとともにプレインキュベーションチャンバーで少なくとも1時間泡立てます。フレームシールガラスマイクロピペットを準備するには、まず、先端径が2マイクロメートルの標準的なパッチクランプマイクロピペットを、燃えるような茶色または同等のマイクロピペットプーラーで引きます。

マイクロピペットの先端をブンゼンバーナーの炎に約2秒間入れて、直径200〜300マイクロメートルの融合ボールを形成します。次に、ピソ電気バイモルフリレーまたは同等の効果的なデバイスを使用して、100〜200マイクロメートルの移動距離で左右に急速に振動できるマイクロマニピュレーターのホルダーに、フレームシールパッチピペットを置きます。ヒープバッファリング生理食塩水を準備します。

水酸化ナトリウムを含む溶液をpH 7.4に、スクロースを含む浸透圧を約300ミリの浸透圧に調整します。次に、直径35ミリメートルの培養皿に、緩衝塩水を山盛りに詰めます。培養皿にスライスを置き、250倍の倍率で解剖ステレオスコープで曲げたワイヤーで視覚化します。

スライスを皿の底に保持して、細胞を解離します。フレームシールされたマイクロピペットの先端をスライス面に置きます。マイクロマニピュレーターを作動させて、先端が約100マイクロメートルの遠距離で10〜30ヘルツで横方向に振動

マイクロピペットの先端をマイクロマニピュレーターでスライスに下げ、30秒以内に全深さを切断します。必要に応じてこの手順を繰り返して、分離されたニューロンの数を最大化します。次に、スライスから先端を取り外します。

鉗子でスライスを拾い上げ、溶液中で静かに振とうします。次に、スライスを溶液から完全に取り出します。細胞が皿の底に少なくとも10分間落ち着くのを待ちます。

ニューロンの入った皿を倒立顕微鏡のステージに置き、1××から63×の対物レンズで可視化します。ブラブがなく、検出可能な、しかし特大ではない滑らかな膜を持つニューロンを探します。位相差光学系を使用する場合は、黄色がかったが青すぎない位相明るいニューロンを探します。

標準のパッチマイクロピペットは、フレーミングブラウンまたは同等のプーラーを使用して、ピペットチップの抵抗が2〜4メガオームです。シナプス応答の測定には塩化セシウムベースの細胞内溶液を、内因性膜特性と活動電位の測定には塩化カリウムベースの細胞内溶液をパッチピペットに充填します。標準的な電気生理学的手法を用いて、ニューロン上で全細胞パッチクランプを行います。

ギャップフリーデータ取得プロトコルを使用して、自発的なシナプス後電流を初めて記録します。次に、200ナンの動物毒素またはテトロ毒素およびまたは低カルシウム含有細胞外溶液を適用して、細胞外分子含有量を変更するためのミニチュアシナプス後電流を記録します。関心のある薬物は、関心のあるニューロンの近くに配置された融合した正方形の先端を持つガラス管のバレルの1つに個別に装填されます。

個々のバレルは、ステッピングモーター駆動のマイクロマニピュレーターによってニューロンに露出され、ステッピングモーター駆動のマイクロマニピュレーターは横方向に移動して溶液交換を10〜100ミリ秒可能にします。カメラベースまたは多光子顕微鏡で、高開口数対物レンズを使用してダウンロードしたbnsを高倍率で見てください。ここに示されているのは、電子増倍電荷結合デバイスカメラでキャプチャされたニューロンとbnsの画像です。

励起用光源の電力は、電圧クランプ記録中に中性光1.0フィルターと12%出力に調整されたアイリスフィルターを使用して1.2%に減衰しました。塩化セシウムベースの細胞内溶液では、自発的なシナプス電流が観察され、膀胱融合が視覚化されます。シナプス前バトンでは、TH one promoterの制御下でシナプスフローリンコンストラクトを発現するマウスを使用しました。

シナプスフローリンは、pH感受性が強化された黄道フローリン、GFP変異体が、膀胱融合時に膀胱関連膜タンパク質に結合する分子構築物です。このモチーフは、より中性的な細胞外環境にさらされ、その結果、小胞とシナプス前末端に対応する点の蛍光が増加します。これらのマウスからの海馬ニューロンの線維解離は、この手順を試みながら、GABA作動性末端に予想されるサイズおよび位置の蛍光点の可視化を可能にする。

健康なニューロンを持つためには、健康なスライスがあることを確認しなければならないことを覚えておくことが重要です。したがって、急性脳スライスの調製は、この手順に続くこの手順の重要なステップです。免疫組織化学やシングルセルRT PCR Rなどの他の方法を実行して、シナプスバトンやシナプス後ニューロンで発現するタンパク質やmRNA種などの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、健康な孤立したニューロンを取得し、それらを電気生理学やリアルタイムイメージングに使用する方法について十分に理解できるはずです。