一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

私はオハイオ州立大学で薬理学の准教授を務めているフレデリック・ディナです。このデモンストレーションでは、EPRスピン・トラッピング法を用いて、細胞から一酸化窒素およびスーパーオキシドを検出する方法を示します。

活性酸素種および活性窒素種は、さまざまな疾患の発症に関与していると考えられており、そのため生物学的システムにおけるこれらの検出は極めて重要です。生物学的システムで活性種を検出するための信頼できる手法はわずかしか採用されておらず、それらは特異性と感度に制限されています。しかし、スピン・トラッピングは活性種の同定に一般的に用いられており、これはラジカルがニトロスピン・トラップまたは金属錯体と付加反応を起こして持続性スピン付加体を形成することを利用します。この付加体は電子常子共鳴分光法（EPR）によって検出可能です。さまざまなラジカル付加体は特徴的なスペクトルを示すため、生成されるラジカルの同定に使用でき、ラジカル生成の性質や速度論に関する豊富な情報を提供することができます。

一酸化窒素合成酵素は、NADPHを用いてL-アルギニンをL-シトルリンに変換し、一酸化窒素を生成します。酸化ストレス条件下では、アンカップリングと呼ばれるプロセスにより、eNOSは一酸化窒素の生成からスーパーオキシドの生成へと切り替わることがあり、これはヘムの酸化や補因子の欠乏によって引き起こされると考えられています。生物学的システムにおける一酸化窒素の調節は、血管拡張などの有益な生理機能をもたらす細胞シグナル伝達において重要な役割を果たすため、非常に重要です。しかし、その過剰産生はしばしば炎症性疾患に関連しています。したがって、生物学的システムにおける一酸化窒素の検出は重要です。

生物学的システムにおけるもう一つの重要なシグナル分子のクラスに、一酸化窒素などの活性酸素種があります。低濃度の活性酸素種は、細胞機能の調節、シグナル伝達、および免疫応答において重要な役割を果たしますが、制御されない濃度になると細胞の酸化損傷を招き、酸化ストレスにつながります。スーパーオキシドアニオンは最も重要な活性酸素種の一つであり、スーパーオキシドニトリトやヒドロキシルラジカルなど、生物学的システムに存在することで知られている極めて酸化力の強い種の大半の主要な前駆体となります。したがって、生物学的システムにおけるスーパーオキシドの検出および捕捉は重要です。なぜなら、その生成は酸化バーストが開始される最初の兆候となるからです。

本プロトコルでは、記述された手順に従って、培養したウシ大動脈内皮細胞をトリプシン処理します。細胞をラベル付きの6ウェルプレートに移し、インキュベーション後、37 °C、5% CO2で一晩インキュベートします。

6ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、1番目のウェルから培地を吸引除去します。1 mLのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で細胞を2回洗浄します。0.8 mgの硫酸鉄を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む1 mLのDPBSに加えることで、1.9 mMの硫酸鉄七水和物溶液を調製します。

塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む500 µLのDPBSに2.7 mgのMGDアンモニウム塩を加え、MGD溶液を調製します。 freshly prepared（調製直後の）1.9 mM硫酸鉄(II)七水和物210 µLと、モル比1:7で調製したMGD溶液210 µLを加え、得られた懸濁液を混合します。カルシウムイオン4を4.6 µL加え、ピペッティングにより溶液を再度混合します。

次に、サンプルを37°Cで36分間インキュベートします。エッペンドルフチューブに沈殿した上清を回収します。EPRの測定パラメータとして、中心磁場を3427 gauss、変調振幅を6 gauss、周波数を9.8 GHzに設定します。

装置や実験条件によってパラメータが異なるため、本装置で使用されるその他のパラメータについては本文をご参照ください。上清をEPRフラットセルに移し、パラフィンで封印してEPRキャビティに設置します。実験開始後、1スキャンあたり10.4秒、計121スキャンで、約21分間スペクトルを記録します。

Brucker WIN EPR 処理を用いてベースライン補正および2Dスペクトルの積分を行い、背景ノイズを低減します。なお、スキャン時間およびスキャン回数は実験によって異なる場合があることに注意してください。また、ベースラインの補正方法は使用するソフトウェアによって異なる場合があります。

Enosの脱共役を開始するには、6ウェルプレートの2番目のウェルから培地を除去し、1 mLのDPBSで細胞を2回洗浄します。次に、調製した0.5 mMのSyn 1溶液を100 µL添加し、10% FBS含有DPBSで液量を2 mLに合わせます。細胞を37 °C、5% CO2で2時間インキュベートし、インキュベーション後、次の手順に進みます。

細胞をDPBSで2回洗浄します。次に、調製したばかりの2.8 millimolar 硫酸鉄(II)七水和物を210 microliters、および前述の手順に従って調製したばかりの19.6 millimolar MGDを210 microliters添加します。続いて、1.9 millimolar カルシウムイオンを4.6 microliters添加し、溶液を再度混合します。

前と同様に、細胞を37°Cで36分間インキュベートします。36分後、エッペンドルフチューブに溜まった上清を回収し、EPRフラットセルに移します。前回の取得時と同じ取得パラメータを用いて、EPRスペクトルを記録します。

本プロトコルの開始前に、同様の方法でデータを処理します。1 MのDMPOストック溶液と、0.1 mMのDTPAを含むPBSを調製します。次に、4-by-12の1 mg/mL溶液を調製します。

Myra State 13 acetateまたはDMSO中のPMAを用い、PBSで10 µg/mLに希釈し、1 mg/mL D-glucoseおよび1 mg/mL アルブミンを含むエッペンドルフチューブに分注して、PMAストック溶液を1 mLずつ作成します。1.5 mLエッペンドルフチューブ内でピペッティングを行い、PMN細胞を5～6 × 10⁶ cells/mLに調整します。PMN細胞約1.6 × 10⁶ cells、10 mM DMPO、および0.2 µg/mL PMAを含む、最終容量60 µLの混合液を調製します。

この実験では、Bruker ESP 300 Xバンド分光計を使用します。溶液をEPRフラットセルに移し、そのフラットセルをEPRキャビティ内に設置します。EPR測定パラメータとして、中心磁場 3.486 gauss、変調振幅 0.5 gauss、周波数 9.8 gigahertz を入力します。

パラメータは装置や実験条件によって異なるため、本実験でスペクトル取得に使用したその他のパラメータについては、本文をご参照ください。本デモンストレーションでは、2種類の異なるスピントラップ（鉄MGDおよびDNPO）を用いて、一酸化窒素およびスーパーオキシドラジカルの検出方法を示します。

カルシウムイオノフォアによる血管内皮細胞の刺激により一酸化窒素が産生され、ペリニトリトドナーによる処理でこの一酸化窒素産生が減少することを示す。しかし、ニトロスピン トラップ存在下でPMAを用いて好中球を刺激すると、最初に形成されたスーパーオキシドアダクトの不安定性に起因して、S-オキシドではなくヒドロキシルラジカルADDAが生成される。MGDニトロサイドによるスピン トラップのメカニズムは基本的に同一である一方、MGDへの一酸化窒素の付加は反応速度が非常に速く、形成されたMGD一酸化窒素付加体は非常に安定している。

実際、溶液を-80°Cで凍結保存しても、EPR信号強度が著しく低下することなく、後日にEPRスペクトルの測定を行うことが可能です。一方で、ニトロスピン トラップを用いた酸化物の検出は速度が遅いため、一酸化窒素検出に用いる鉄MGDと比較して、より高濃度のスピン トラップが必要となります。

スーパーオキシド付加体形式を正常に検出するために、いくつかの手法が採用されていますが、本ビデオではそれらについて詳しく説明しません。例えば、フラットセルの使用は、セル密度が高くなるため、より高いスーパーオキシド付加体信号強度が得られる可能性があります。この件については、テキストを参照することをお勧めします。

また、DMPOの代わりに、BMPOやVMPなどの認定済みのスピン トラップ、またはより持続性の高いSU過酸化物付加体を生成できるリン酸化Nitro DAP MPOを使用することも可能です。US検出のためにスピン トラッピングを用いる際、SU過酸化物付加体を安定化させるためにシクロデキストリンの使用も採用されています。SUスーパーオキシド生成後、直ちにEPスペクトルを取得することを強く推奨します。

したがって、鉄MGDを用いた一酸化窒素の検出は非常に効率的であり、超酸素ラジカルのPRスピン・トラッピングにおける現在の主な課題は、鉄MGDの一酸化窒素付加体形成に見られる特性、すなわち、迅速な超酸素ラジカル反応性と安定した付加体の形成を実現することです。超酸素ラジカルに対して迅速に反応し、安定したスピン付加体を形成するスピン・トラップの開発に向けた取り組みが、現在当研究室および他の研究グループによって行われています。