一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

私はフレデリック・ディナです。オハイオ州立大学の薬理学准教授を務めております。このデモンストレーションでは、EPRスピン・トラッピングを用いて、細胞から一酸化窒素およびスーパーオキシドを検出する方法を紹介します。

活性酸素種および活性窒素種は、さまざまな疾患の発症に関与しているため、生物学的システムにおけるこれらの検出は極めて重要です。生物学的システムでの活性種の検出に用いられる信頼性の高い方法はごくわずかであり、それらは特異性と感度に制限があります。一方、スピン・トラッピング法は活性酸素種の同定に一般的に用いられており、ラジカルがニトロスピン・トラップや金属錯体と付加反応を起こして安定なスピン付加体（スピンアダクト）を形成させる手法です。これは電子常磁性共鳴（EPR）分光法で検出することができ、さまざまなラジカル付加体は固有のスペクトルを示すため、生成されたラジカルの同定に利用でき、ラジカル生成の性質や速度論に関する豊富な情報を提供することが可能です。

一酸化窒素合成酵素は、N-A-D-P-Hを用いてL-アルギニンからL-シトルリンへの変換を触媒し、一酸化窒素を生成します。酸化ストレス条件下では、アンカップリングと呼ばれるプロセスにより、eNOSは一酸化窒素の生成からスーパーオキシドの生成へと切り替わることがあり、これはヘムの酸化やコファクターの喪失によって引き起こされると考えられています。生体系における一酸化窒素の調節は、血管拡張などの有益な生理機能をもたらす細胞シグナル伝達において重要な役割を果たすため極めて重要ですが、その過剰生成はしばしば炎症性疾患に関連しています。したがって、生体系における一酸化窒素の検出は重要です。

生物学的システムにおけるもう一つの重要なシグナル伝達分子のクラスは、一酸化窒素などの活性酸素種です。低濃度の活性酸素種は、細胞機能、シグナル伝達、および免疫応答の調節において重要な役割を果たしますが、制御不能な濃度になると、細胞の酸化損傷を引き起こし、酸化ストレスにつながります。スーパーオキシドラジカルアニオンは最も重要な活性酸素種の一つであり、スーパーオキシドニトリトやヒドロキシラジカルなど、生物学的システムに存在することが知られている極めて酸化力の強い種の主要な前駆体となります。したがって、生物学的システムにおけるスーパーオキシドの検出および捕捉は重要です。なぜなら、その生成は酸化バーストの最初の兆候を知らせるためです。

このプロトコルでは、記載の手順に従って、培養したウシ大動脈内皮細胞をトリプシン処理します。細胞をラベル付けした6ウェルプレートに移し、インキュベーション後、37 °C、5% CO2で一晩インキュベートします。

6ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、最初のウェルから培地を吸引します。細胞を1 mLのカルシウム・マグネシウム含有リン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で2回洗浄します。0.8 mgの硫酸第一鉄を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む1 mLのDPBSに加えることで、1.9 mMの硫酸第一鉄七水和物溶液を調製します。

カルシウムおよびマグネシウムを含むDPBS 500 µLに、2.7 mgのアンモニウムMGDを加えてMGD溶液を調製します。 freshly prepared 1.9 mMの硫酸第一鉄七水和物210 µLと、モル比1:7で調製した freshly prepared MGD 210 µLを加え、得られた懸濁液を混合します。さらにカルシウムイオン4を4.6 µL加え、ピペッティングにより溶液を再度混合します。

次に、サンプルを37 °Cで36分間インキュベートします。エッペンドルフチューブに回収された上清を回収します。EPR取得パラメータとして、中心磁場 3427 gauss、変調振幅 6 gauss、周波数 9.8 GHzを入力します。

装置や実験条件によってパラメータが異なるため、本機器で使用されるその他のパラメータについては本文をご参照ください。上清をパラフィンで密封したEPRフラットセルに転送し、EPRキャビティに設置します。実験開始後、1スキャンあたり10.4秒で121スキャン、約21分間かけてスペクトルを記録します。

Brucker WIN EPR 処理を用いてベースライン補正および 2D スペクトルの積分を行い、バックグラウンドノイズを低減させます。なお、スキャン時間およびスキャン回数は、実験ごとに異なる場合があることに注意してください。また、ベースライン補正の手法も、使用するソフトウェアによって異なる場合があります。

Enosの脱共役を開始するには、6ウェルプレートの2番目のウェルから培地を除去し、1 mLのDPBSで細胞を2回洗浄します。次に、調製した0.5 mMのSyn one溶液を100 µL添加し、10%FBSを含むDPBSで容量を2 mLにします。細胞を37 °C、5% CO2で2時間インキュベートします。インキュベート後、

細胞をDPBSで2回洗浄します。次に、調製したばかりの2.8 millimolar 硫酸鉄(VII)七水和物を210 microlitersと、前述の手順に従って調製したばかりの19.6 millimolar MGDを210 microliters添加します。続いて、1.9 millimolar カルシウムイオンを4.6 microliters添加し、溶液を再度混合します。

前と同様に、細胞を37°Cで36分間インキュベートします。36分後、エッペンドルフチューブ内に沈殿した上清を回収し、EPRフラットセルに移します。前回の取得時と同じ取得パラメータを用いて、EPRスペクトルを記録します。

本プロトコルの開始前に、同様の手順でデータを処理します。1 MのDMPOストック溶液と、0.1 mMのDTPAを含むPBSを準備します。その後、4×12の1 mg/mL溶液を作成します。

DMSOに溶解したMyristate 13 acetate（PMA）を用い、1 mg/mLのD-glucoseおよび1 mg/mLのアルブミンを含むエッペンドルフチューブで、PMAストック溶液を10 µg/mLにPBSで希釈し、1 mLずつ分注して分注液を作成します。1.5 mLのエッペンドルフチューブ内でピペッティングを行い、PMN細胞の濃度を5～6 × 10⁶ cells/mLに調整します。約1.6 × 10⁶ cellsのPMN、10 mMのDMPO、および0.2 µg/mLのPMAを含む、最終容量60 µLの混合液を調製します。

この実験では、Bruker ESP 300 Xバンド分光計を使用します。溶液をEPRフラットセルに移し、フラットセルをEPRキャビティに設置します。EPR測定パラメータとして、中心磁場を3, 486 goss、変調振幅を0.5 goss、周波数を9.8 gigahertzに設定してください。

パラメータは装置や実験条件によって異なるため、本実験でスペクトル取得に使用したその他のパラメータについては本文をご参照ください。このデモンストレーションでは、2種類の異なるスピン・トラップ（鉄MGDおよびDNPO）を用いて、一酸化窒素およびスーパーオキシドラジカルの検出方法を示します。

カルシウムイオノフォアによる血管内皮細胞の刺激で一酸化窒素が産生されること、およびニトロニトリトドナーによる処理で一酸化窒素の産生が抑制されることを示します。しかし、ニトロスピン トラップ存在下でPMAを用いて好中球を刺激すると、最初に形成されたスーパーオキシドアドダクトが不安定であるため、一酸化窒素アドダクトではなくヒドロキシルラジカルADDAが生成されます。Fe-MGDによるスピン トラップのメカニズムは基本的に同一ですが、Fe-MGDへの一酸化窒素の付加は反応速度が非常に速く、形成されたFe-MGD一酸化窒素アドダクトは極めて安定しています。

実際、溶液を-80 °Cで凍結保存しても、EPR信号強度が著しく低下することなく、後でEPRスペクトルを測定することが可能です。一方で、ニトロスピントラップを用いた酸化窒素の検出は速度が遅いため、鉄MGDを用いた一酸化窒素検出の場合と比較して、より高濃度のスピントラップが必要となります。

スーパーオキシド付加体を正常に検出するために、いくつかの手法が採用されてきましたが、本ビデオではそれらについて詳しく説明しません。例えば、フラットセルを使用することで、細胞密度が高まり、スーパーオキシド付加体のシグナル強度を向上させることができます。この点については、本文をご参照ください。

また、DMPOの代わりに、BMPOやVMPなどの認定されたスピン・トラップや、より持続性の高いSUペルオキシド付加体を生成できるリン酸化Nitro DAP MPOを使用することも可能です。US検出のためにスピン・トラッピングを用いる際、SUペルオキシド付加体を安定化させるためにシクロデキストリンが使用されることもあります。SUスーパーオキシドの生成後、直ちにEPスペクトルを取得することを強く推奨します。

したがって、鉄MGDを用いた一酸化窒素の検出は非常に効率的であり、超酸化物のPRスピン trapping における現在の主な課題は、鉄MGDの一酸化窒素付加体形成に見られる特性、すなわち、迅速な超酸化物反応性と安定な付加体形成を実現することです。超酸化物に対して迅速に反応し、安定なスピン付加体を形成するスピン trapping 剤の開発に向けた取り組みが、現在、当研究室および他のグループによって進められています。