Name: 一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 学ぶ 一酸化窒素とスーパーオキシドラジカルの検出法。EPR分光法とスピントラップを用いて細胞から活性酸素種を検出する技術を習得し、神経科学や生化学研究への応用を理解できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、NIHの国立心臓、肺、血液研究所の助成金RO1 HL81248によって資金を供給された。

1。ウシ大動脈内皮細胞（BAEC）の培養<ol><li>適切な無菌テクニックが続いていた。 </li><li> 37抗生物質なしで水浴、暖かい培地℃で</li></ol> 注：培地は4.5 g / LのD-グルコースとフェノールフリーダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で構成されており、10％ウシ胎児血清（FBS）および2.5を添加した4 mM L-グルタミン、1％非必須アミノ酸、 mg / Lの内皮細胞増殖因子。 <ol start="3"><li>インキュベーターからT75フラスコを含むセルを削除し、フードの内側に配置する前に、70％エタノールでフラスコの表面を清掃してください。 </li><li>アスピレーターを使用して、古い培地を除去し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の5 mlで2回洗浄する。 </li><li>トリプシンの2ミリリットルを追加し、定期的に顕微鏡下で検査しながら切断する細胞4-5分間待ちます。 </li><li>培地3mlを追加して、繰り返して、別のtにピペットを用いて混在させる彼は細胞とも懸濁液を作成します。 </li><li> 5分間121グラムで15 mlのチューブと遠心分離機にトリプシンで培地5mlを転送します。 </li><li>アスピレーターを用いて上清を取り除きます。 DPBS 5mlを加え、よく混ぜます。 5分間121グラムで遠心します。 </li><li>上清を吸引除去し、培地6mlを加えることによって細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 6ウェルプレートに、ウェルを培地1mlを追加するたびに細胞懸濁液1 mlを加える。ピペットを用いて懸濁液を混ぜる。 </li><li>ラベルプレートと37℃、5％CO 2を一晩インキュベートする。 </li></ol> 2A。 BAEC細胞とNOの検出<ol><li>適切な無菌テクニックが続いていた。 </li><li>インキュベーターから6ウェルプレートを取り外し、最初のウェルから培地を吸引除去する。 1 mlのDPBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li> 1.9 mMの硫酸鉄（II）七水和物（のFeSO 4·7H 2 O、で0.8 mgを溶解することによって新たに準備する210μlを加え1 mlのCaCl 2とMgCl 2を持つDPBS）とアンモニウム210μlの午前1時07分の比を用いてN-メチル-D-グルカミンジチオカルバメート（MGD、CaCl 2とMgCl 2を 500μlのDPBSで2.7 mgを溶解することにより、新たに調製） （注：過剰MGDが使用されているこの比率は、従来のFe 3の収率は+-MGDを過剰MGDの存在下で最大化されているという事実に起因+ MGD複雑なのFe 2準備のために採用されているのに加え。 NO-のFe 3 +が -MGD形成されたので、+-MGDは必要ありませんFe 2 +を安定させるために溶液中でアスコルビン酸は内因性アスコルビン酸、ヒドロキノン、または最大の変換効率を持つシステイン+ MGD EPR検出可能なNO-Feの2に削減され99.9％...のFe 2低スピン反磁性の状態が+ NO）低温装置を必要とせずにフラットセルまたはキャピラリーチューブを用いた 15 の検出することができます 。 </li><li>よくスワール得られた懸濁液を、4.6μを追加するカルシウムイオノフォアのL（CAI）（1ミリリットルのDMSOに1mgを溶解することにより1.9 mMのストック溶液から調製）。 </li><li>スワール再びソリューションと37℃36分のためにCをさらにNO-Feの3の削減を可能にするためには、EPR検出可能なNO-Fe 2 +の -MGDに+ MGD。 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブとEPRフラットセル（または50μlのキャピラリーチューブへの）への転送の上清（425μl）を収集します。 </li><li> EPR取得パラメータは以下のとおりです。マイクロ波周波数：9.8 GHzの、中央のフィールド：3427 G;変調振幅：6.0 G、掃引幅：100 G;レシーバゲイン：1×10 5、マイクロ波電力：10 mWで、スキャンの総数：121;掃引時間：10秒、および時定数：20ミリ秒（注：パラメータはひとつの楽器と実験条件ごとに異なりますので、したがって、唯一のセンターフィールド周波数と変調振幅が考慮すべき最も重要なパラメータである。） </li><li>室温でのスペクトルを記録し、2次元スペクトルは、INTEGたブルカーWinEPRデータ処理ソフトウェアやその他のデータ処理ソフトウェアを用いて補正し、バックグラウンドノイズやベースラインを減らすために評価した。付加体形成の定量化については、濃度対信号強度（又は面積）の標準的なプロットは、NOドナーSNAPを使用しない構築することができます。 </li></ol> 2B。 eNOSのアンカップリング実験<ol><li>インキュベーターから6ウェルプレートを取り外し、第2ウェルから培地を吸引し、1 mlのDPBSで2回洗浄する。 </li><li>ペルオキシナイトライトのドナー、5 -アミノ-3 - （4 -モルホリニル）-1,2,3 - oxadiazolium塩化物（SIN-1）はeNOSの16を切り離すために使用された。 0.5mMのSIN-1（M R 206.6たてないのCa / Mgのイオンを含むPBS 500μlの1 mgのSIN-1を溶解して調製10mMストック溶液からg /モル）、希に2ミリリットルのDPBSの100μlを加えおよび10％FBS。 </li><li> 37℃で2時間インキュベート℃、5％CO 2。 </li><li>インキュベーターからプレートを削除し、DPBSで2回洗浄する。 </li><li> 210μlを加え2.8mmでのFeSO 4·7H 2 O、19.6 mMの210μlを新たに上記の手順に従って調製MGD。 </li><li>渦解と1.9 mMのCAIの4.6μlを追加します。 </li><li>スワール再びソリューションと36分間37℃でインキュベートする。 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブとEPRフラットセルへの転送の上清（425μl）を収集します。 </li><li> EPR取得パラメータは以下のとおりです。マイクロ波周波数：9.8 GHzの、中央のフィールド：3427 G;変調振幅：6 G;掃引幅：100 G;レシーバゲイン：1×10 5、マイクロ波電力：10 mWで、スキャンの総数：121;掃引時間：10秒、および一定時間：20ミリ秒。 </li><li>スペクトルを記録し、2次元スペクトルは、前述したように補正し、バックグラウンドノイズやベースラインを減らすために統合されました。 </li></ol> 3。 O 2の検出• -多形核好中球からの（多形核白血球） <ol><li>以前に17に記載のように好中球は、ヒトの血液サンプルから単離された。 </li><li>ジエチレントリアミン5酢酸（DTPA）は0.1mMを含むPBSで1 M DMPO *のストック溶液を作成します。 DMPOは、25から29の融点を有する°C、それがガラスバイアル（注に液体DMPO（密度〜1.02グラム/ mlの25℃）ピペッティングする方が便利ですので、：純粋なDMPOので、計量プラスチックバイアルを使用しないでください。 ）プラスチックと反応します 。凍結DMPOは、バイアル（：DMPOが分解可能性があるのでお湯を実行しないでください注）へとルーク温水を実行することによって溶融させることができる。 </li><li>それ以来、高純度DMPOを（&gt; 99％）を使用することが重要である市販のスピントラップの一部は、常磁性不純物を含んでおり、したがって、それは単独でだけDMPO溶液のEPRスペクトル（このケースでは10 mM）を実行することが不可欠です。それはバックグラウンド信号（ 図3Aを参照）は明らかではないことが重要です。 </li><li> DMSO中のホルボール-12 - ミリステート-13 - アセテート（PMA）のストック溶液（1 mg / ml）を準備します。 PBSで10μg/ mlの解決策を希釈することにより、アリコートを行います。 </li><li> 1。5ミリリットルエッペンドルフチューブには、添加の順序に従うことによって0.6ミリリットルの合計体積で解決策を準備します。PMNのmlあたり〜10 6細胞、D-グルコース（1 mg / ml）とアルブミン（1 mg / ml）を、10 mMのDMPOとPMA 0.2μg/ mlの。（注：PMAは、急進的な活性化因子であると最後に追加する必要があります）。 </li><li> EPRフラットセルに溶液を移します。 </li><li> EPR取得パラメータの条件は次のとおりです。マイクロ波周波数：9.8 GHzの、中央のフィールド：3486 G;変調振幅：0.5 G、掃引幅：100 G;レシーバゲイン：5×10 5;スキャンの総数：10;掃引時間：30秒、マイクロ波電力：20 mWで、そして一定時間：81 msです。付加体形成の定量化については、濃度対信号強度（または地域）の標準的なプロットは、そのようなテンポや-3 - カルボン酸-PROXYLとして安定したニトロキシドを用いて構築することができます。 </li></ol> DMPOの利用に関する重要な注意：フラットセルを使用することにより、一つの細胞密度を高め、それによって信号を増加させることができスピンアダクトの強さがO 2の半減期• - DMPOの付加物が短い（T 1/2〜1分）DMPO-OHに分解する。 DMPOは、t 1/2〜8とそれぞれ14分、と増加した付加物の安定性のために市販されているEMPO、BMPOまたはDEPMPOの同じ濃度を用いて置換することができます。 4。代表的な結果のFe 2からのEPRシグナルを示していない+ MGD又はFe 2の混合物は、CAIと+-MGDバックグラウンド信号があり、これらの試薬 ​​に由来しないことを示すラジカル+ MGD 図2Aおよび2BのFe 2を用いて行われたNOのスピン捕捉。のFe 2と反応してCAIのリリースNO刺激によりBAECスピン付加物を形成するために+-MGD、NO-のFe 2 +-MGDと、N = 12.66 Gの超微細分裂定数（HFSC）の値を持つ特徴的なトリプレット信号を示し、 G = 2.040のg因子。 （ 図2C）。 HFSC値は、NIEHS EPRソフトウェアデータベースのWebサイトからダウンロードすることができますWINSIMシミュレーションプログラムを用いて決定した。実験的なHFSCは、NO-のFe 2 +-MGD付加のためにN = 12.70 Gとg = 2.041 18の文献値と一致しています。同様に、BAEC上にSIN-1の効果は、 図2Dに示すように、eNOSのは、脱共役によるNO産生を低下させません。 検出- DMPOスピントラップは、O 2•使用されました。スピントラップは常磁性不純物から自由であることを確認し、図3Aに示すように、DMPOは、単独でシグナルを与えなかった。 図3Bは、唯一のDMPOとPMNのスペクトルであり、同様に、DMPOが発生しないことを示唆して検出可能なシグナルはありません酵素NADPHオキシダーゼの活性化を図3Cは、PMAによるPMNの刺激時に ​​観察されたEPR信号を示しています。この信号のHFSCの値は、N = 14.71 G、＆であると決定されたβ、-H = 11.40 G、γ-H = 1.25 G、およびN = 14.3 G、β-H = 11.7 Gとγ-H = DMPO-O 1.3 G 19の文献値と一致している2 H付加。 <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：EPRスピントラップを用いた好中球およびBAECからラジカルを検出するためのフローチャート。 （A）PMNはDMPOとPMAと混合し、得られた混合物は、データ取得のためのEPRフラットセルに転送されます。 （B）BAECは、プレート上に成長し、DPBSで洗浄した。スピントラップのFe（MGD）2 CAIと一緒に追加されました。溶液が十分に混合し、インキュベートした。混合物は、EPRのデータ取得のためのEPRフラットセルに移した。 <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 BからのNOのEPR検出AEC。のFe 2 + MGD + CAIの（）のFe 2スペクトラム+ MGDのみ（B）スペクトルのみ。 （C）のFe 2 NOトラップに起因するトリプレットスペクトルは+-MGD CAI-刺激した細胞を使用します。 （D）スペクトルは、0.5 mMの細胞のSIN-1処理によるNO産生の減少を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3活性化好中球からのDMPO-O 2 HのEPRを検出します。 10 mMのDMPOの（A）スペクトルのみ。 （B）の10 mM DMPOの存在下で単独でPMNのスペクトル。 （C）PMNのスペクトルは、10 mMのDMPOの存在下でPMAによって活性化。

<ol><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconciling+the+chemistry+and+biology+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol+chemistry+and+specificity+in+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Thiol chemistry and specificity in redox signaling.</a> Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Oxygen%2C+Gene+Expression%2C+and+Cellular+Function%22">Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function</a>. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).</li>
<li>Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants%3A+Molecules%2C+medicines%2C+and+myths%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Antioxidants: Molecules, medicines, and myths.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).</li>
<li>Sumimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+regulation+and+evolution+of+Nox-family+NADPH+oxidases+that+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species.</a> FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgnarro%2C+LJ+%22Editor+Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Pathobiology%22">Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).</li>
<li>Moreau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alkyl-+and+arylguanidines+on+the+stability+and+reactivity+of+inducible+NOS+heme-dioxygen+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes.</a> Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).</li>
<li>Vasquez-Vivar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+generation+by+endothelial+nitric+oxide+synthase%3A+the+influence+of+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+by+EPR+spin+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping.</a> Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+superoxide+and+hydroxyl+radical%3A+practical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects.</a> Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28DEPMPO%29%3A+a+new+phosphorylated+nitrone+for+the+efficient+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).</li>
<li>Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3%2C4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide%3A+Evaluation+of+the+spin+trapping+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties.</a> Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+radical+trapping+and+spin+adduct+decay+of+5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28BocMPO%29%3A+kinetics+and+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Perkin+Trans%22%5BJournal%5D)">Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).</li>
<li>Tsuchiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-forming+reactions+of+the+water-soluble+nitric+oxide+spin-trapping+agent%2C+MGD%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD.</a> Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).</li>
<li>Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+iron-dithiocarbamates+ensure+detection+of+nitric+oxide+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues.</a> Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).</li>
<li>RojasWahl, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomposition+mechanism+of+3-N-morpholinosydnonimine+%28SIN-1%29%3A+A+density+functional+study+on+intrinsic+structures+and+reactivities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Model%22%5BJournal%5D)">Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities.</a> J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).</li>
<li>Klempner, M. S., Gallin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+functional+characterization+of+human+neutrophil+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations.</a> Blood. 51, 659-669 (1978).</li>
<li>Pou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+nitric+oxide+by+ferro-chelates%3A+kinetic+and+in+vivo+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping.+Kinetics+of+the+reaction+of+superoxide+and+hydroxyl+radicals+with+nitrones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones.</a> J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).</li>
<li>Britigan, B. E., Rosen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin-trapping+and+human+neutrophils.+Limits+of+detection+of+hydroxyl+radical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical.</a> J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-%28Diethoxyphosphoryl%29-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide%3A+A+new+efficient+phosphorylated+nitrone+for+the+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).</li>
<li>Snyrychova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+sensitivity+of+EPR+spin+trapping+in+biological+systems+by+cyclodextrins%3A+A+model+study+with+thylakoids+and+photosystem+II+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles.</a> Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).</li>
<li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+beta-cyclodextrin+cyclic-nitrone+conjugate%3A+Synthesis+and+spin+trapping+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies.</a> J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).</li>
<li>Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+spin+trapping+properties+by+beta-cyclodextrin-cyclic+nitrone+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate.</a> J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).</li>
<li>Hardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization%2C+and+decay+kinetics+of+ROS+and+thiyl+adducts+of+mito-DEPMPO+spin+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap.</a> Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).</li>
<li>Kim, S. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+reactivity+of+a+cyclic+nitrone-calix%5B4%5Dpyrrole+conjugate+with+superoxide+radical+anion%3A+Theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

EPRスピントラップは、フリーラジカルを定量化し、識別するための生物医学アプリケーションの広い範囲で採用されている。スピントラッピングは、nMからこのように生物系のアプリケーションに適していμMの範囲の濃度でラジカルを検出することができる、非常に敏感である。常磁性の付加物の形成、NO-のFe 2 +-MGDは、EPR を経由して NOの検出の基礎となっています。のFe 2〜10 6 M -1 s -1の速度で急速にNO 18と+-MGD反応。 NO-のFe 2 +-MGD付加物は長い半減期を持っており、非常に安定しています。サンプルは°Cの重要な信号強度（未発表データ）で失うことなく、+-MGD NO-Fe 2 +を含む-80ソリューションを凍結することによって収集された後、実際には、一つは24時間以内にEPRスペクトルを取得することができます。のFe 2 +-MGDの欠点は、それが空気に敏感であり、...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>フェノールフリーDMEM培地 高グルコース1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖因子</td><td>ミリポア</td><td> 02から102 </td><td></td></tr><tr><td> CAI </td><td>エンツォ生命科学</td><td> A-23187 </td><td> DMSOに溶解</td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td>エンツォ生命科学</td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td>同仁化学研究所</td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td>のFeSO 4·7H 2 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 215422-250G </td><td> CaとMgを含むPBSに溶解し</td></tr><tr><td> MGD </td><td>エンツォ生命科学</td><td> ALX-400-014-M050 </td><td>のCa 2 +およびMg 2を含むPBSに溶解+ </td></tr><tr><td> BAEC細胞</td><td>セルシステム</td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td>のCaCl 2とMgCl 2とDPBS </td><td>シグマldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td>ホルボールミリステートアセテート（PMA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 79346-1mgの</td><td></td></tr></tbody></table>

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

低濃度で反応性窒素/酸素種（ROS / RNS）は、シグナル伝達、細胞機能の調節に重要な役割を果たしていると、免疫応答が無秩序な濃度で細胞生存率を1、2に有害である。生きているシステムでは、ROSの生成を調節する内因性および栄養抗酸化防御機構と進化してきた一方で、ROSは、酸素の正常な代謝の副産物自然に連続的に製造されており、タンパク質の機能の喪失、DNAの切断、または脂質に生じる生体分子への酸化的損傷を引き起こす可能性があります過3、最終的に細胞傷害または死亡を4につながる酸化ストレスに。 スーパーオキシドアニオンラジカル（O 2• - ）は、ペルオキシナイトライトとヒドロキシルラジカルのような生物学的システムに存在することが知られている最も高度な酸化種のいくつかの主要な前駆体である。 O 2の生成• -私は、したがって、酸化的バーストの最初の兆候を通知し、TSの検出および/または生物学的システムの隔離が重要である。このデモでは、O 2• -多形核好中球（多形核白血球）から生成されました。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）オキシダーゼ5の活性化を介して-ホルボール-12 -ミリステート-13 -アセテート（PMA）と走化性刺激により、PMN。•O 2を生成します 。 3つのアイソフォームで提供一酸化窒素（NO）合成酵素は、誘導-、神経と血管内皮-NOS、またはiNOSの、nNOSのか、eNOSのは、それぞれ、番号6を生成しないようにNADPHを用いて、L-シトルリンにL-アルギニンの変換を触媒として。ここでは、内皮細胞からNOを生成しません。酸化的ストレス条件下で、例えばeNOSのは•O 2、NOを生産に切り替えることができます-ヘム7または補助因子の酸化によって引き起こされると考えられている脱共役と呼ばれるプロセスで、テトラヒドロビオプテリン（BH 4）8。 少数がありますしかし、生体系におけるフリーラジカルの検出のための信頼できる方法は特異性と感度によって制限されます。スピントラッピングは、一般的にフリーラジカルの同定に使用され、電子常磁性共鳴（EPR）分光法によって検出することができる永続的なスピン付加物を形成するスピントラップへのラジカルの付加反応を伴うされています。様々なラジカル付加物は、生成されるラジカルを識別し、ラジカルの産生9の性質と動態に関する豊富な情報を提供することができます使用することができる独特のスペクトルを示す。 環状ニトロン、5,5 -ジメチル-ピロリン-N-オキシド、DMPO 10、ホスホリル置換されDEPMPO 11、エステル置換EMPO 12 BMPO 13は 、広くスピントラップとして採用されている-後者のスピン付加-トラップは、O 2•のために長い半減期を示す。鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオカルバミン酸のFe（MGD）2 &lt;/ SUB&gt;は、一般的に付加体形成とスピン付加物14の高安定度の高い率のためにNOを捕捉するために使用されていません。

電子常磁性共鳴（EPR）分光法はウシ大動脈内皮細胞および鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオ、Feを（MGD）を用いてヒト好中球からのスーパーオキシドラジカルアニオンから一酸化窒素を検出するために採用した<sub&gt; 2</sub&gt;と、それぞれ5,5 - ジメチル-1 - pyroroline-N-オキシド、DMPO、。

低濃度の活性窒素種および活性酸素種（RNS/ROS）は、細胞機能、シグナリング、および免疫応答の調節において重要な役割を果たすが、...

私はオハイオ州立大学で薬理学の准教授を務めているフレデリック・ディナです。このデモンストレーションでは、EPRスピン・トラッピング法を用いて、細胞から一酸化窒素およびスーパーオキシドを検出する方法を示します。活性酸素種および活性窒素種は、さまざまな疾患の発症に関与していると考えられており、そのため生物学的システムにおけるこれらの検出は極めて重要です。生物学的システムで活性種を検出するための信頼できる手法はわずかしか採用されておらず、それらは特異性と感度に制限されています。しかし、スピン・トラッピングは活性種の同定に一般的に用いられており、これはラジカルがニトロスピン・トラップまたは金属錯体と付加反応を起こして持続性スピン付加体を形成することを利用します。この付加体は電子常子共鳴分光法（EPR）によって検出可能です。さまざまなラジカル付加体は特徴的なスペクトルを示すため、生成されるラジカルの同定に使用でき、ラジカル生成の性質や速度論に関する豊富な情報を提供することができます。一酸化窒素合成酵素は、NADPHを用いてL-アルギニンをL-シトルリンに変換し、一酸化窒素を生成します。酸化ストレス条件下では、アンカップリングと呼ばれるプロセスにより、eNOSは一酸化窒素の生成からスーパーオキシドの生成へと切り替わることがあり、これはヘムの酸化や補因子の欠乏によって引き起こされると考えられています。生物学的システムにおける一酸化窒素の調節は、血管拡張などの有益な生理機能をもたらす細胞シグナル伝達において重要な役割を果たすため、非常に重要です。しかし、その過剰産生はしばしば炎症性疾患に関連しています。したがって、生物学的システムにおける一酸化窒素の検出は重要です。生物学的システムにおけるもう一つの重要なシグナル分子のクラスに、一酸化窒素などの活性酸素種があります。低濃度の活性酸素種は、細胞機能の調節、シグナル伝達、および免疫応答において重要な役割を果たしますが、制御されない濃度になると細胞の酸化損傷を招き、酸化ストレスにつながります。スーパーオキシドアニオンは最も重要な活性酸素種の一つであり、スーパーオキシドニトリトやヒドロキシルラジカルなど、生物学的システムに存在することで知られている極めて酸化力の強い種の大半の主要な前駆体となります。したがって、生物学的システムにおけるスーパーオキシドの検出および捕捉は重要です。なぜなら、その生成は酸化バーストが開始される最初の兆候となるからです。本プロトコルでは、記述された手順に従って、培養したウシ大動脈内皮細胞をトリプシン処理します。細胞をラベル付きの6ウェルプレートに移し、インキュベーション後、37 °C、5% CO2で一晩インキュベートします。6ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、1番目のウェルから培地を吸引除去します。1 mLのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で細胞を2回洗浄します。0.8 mgの硫酸鉄を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む1 mLのDPBSに加えることで、1.9 mMの硫酸鉄七水和物溶液を調製します。塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む500 µLのDPBSに2.7 mgのMGDアンモニウム塩を加え、MGD溶液を調製します。 freshly prepared（調製直後の）1.9 mM硫酸鉄(II)七水和物210 µLと、モル比1:7で調製したMGD溶液210 µLを加え、得られた懸濁液を混合します。カルシウムイオン4を4.6 µL加え、ピペッティングにより溶液を再度混合します。次に、サンプルを37°Cで36分間インキュベートします。エッペンドルフチューブに沈殿した上清を回収します。EPRの測定パラメータとして、中心磁場を3427 gauss、変調振幅を6 gauss、周波数を9.8 GHzに設定します。装置や実験条件によってパラメータが異なるため、本装置で使用されるその他のパラメータについては本文をご参照ください。上清をEPRフラットセルに移し、パラフィンで封印してEPRキャビティに設置します。実験開始後、1スキャンあたり10.4秒、計121スキャンで、約21分間スペクトルを記録します。Brucker WIN EPR 処理を用いてベースライン補正および2Dスペクトルの積分を行い、背景ノイズを低減します。なお、スキャン時間およびスキャン回数は実験によって異なる場合があることに注意してください。また、ベースラインの補正方法は使用するソフトウェアによって異なる場合があります。Enosの脱共役を開始するには、6ウェルプレートの2番目のウェルから培地を除去し、1 mLのDPBSで細胞を2回洗浄します。次に、調製した0.5 mMのSyn 1溶液を100 µL添加し、10% FBS含有DPBSで液量を2 mLに合わせます。細胞を37 °C、5% CO2で2時間インキュベートし、インキュベーション後、次の手順に進みます。細胞をDPBSで2回洗浄します。次に、調製したばかりの2.8 millimolar 硫酸鉄(II)七水和物を210 microliters、および前述の手順に従って調製したばかりの19.6 millimolar MGDを210 microliters添加します。続いて、1.9 millimolar カルシウムイオンを4.6 microliters添加し、溶液を再度混合します。前と同様に、細胞を37°Cで36分間インキュベートします。36分後、エッペンドルフチューブに溜まった上清を回収し、EPRフラットセルに移します。前回の取得時と同じ取得パラメータを用いて、EPRスペクトルを記録します。本プロトコルの開始前に、同様の方法でデータを処理します。1 MのDMPOストック溶液と、0.1 mMのDTPAを含むPBSを調製します。次に、4-by-12の1 mg/mL溶液を調製します。Myra State 13 acetateまたはDMSO中のPMAを用い、PBSで10 µg/mLに希釈し、1 mg/mL D-glucoseおよび1 mg/mL アルブミンを含むエッペンドルフチューブに分注して、PMAストック溶液を1 mLずつ作成します。1.5 mLエッペンドルフチューブ内でピペッティングを行い、PMN細胞を5～6 × 10⁶ cells/mLに調整します。PMN細胞約1.6 × 10⁶ cells、10 mM DMPO、および0.2 µg/mL PMAを含む、最終容量60 µLの混合液を調製します。この実験では、Bruker ESP 300 Xバンド分光計を使用します。溶液をEPRフラットセルに移し、そのフラットセルをEPRキャビティ内に設置します。EPR測定パラメータとして、中心磁場 3.486 gauss、変調振幅 0.5 gauss、周波数 9.8 gigahertz を入力します。パラメータは装置や実験条件によって異なるため、本実験でスペクトル取得に使用したその他のパラメータについては、本文をご参照ください。本デモンストレーションでは、2種類の異なるスピントラップ（鉄MGDおよびDNPO）を用いて、一酸化窒素およびスーパーオキシドラジカルの検出方法を示します。カルシウムイオノフォアによる血管内皮細胞の刺激により一酸化窒素が産生され、ペリニトリトドナーによる処理でこの一酸化窒素産生が減少することを示す。しかし、ニトロスピン トラップ存在下でPMAを用いて好中球を刺激すると、最初に形成されたスーパーオキシドアダクトの不安定性に起因して、S-オキシドではなくヒドロキシルラジカルADDAが生成される。MGDニトロサイドによるスピン トラップのメカニズムは基本的に同一である一方、MGDへの一酸化窒素の付加は反応速度が非常に速く、形成されたMGD一酸化窒素付加体は非常に安定している。実際、溶液を-80°Cで凍結保存しても、EPR信号強度が著しく低下することなく、後日にEPRスペクトルの測定を行うことが可能です。一方で、ニトロスピン トラップを用いた酸化物の検出は速度が遅いため、一酸化窒素検出に用いる鉄MGDと比較して、より高濃度のスピン トラップが必要となります。スーパーオキシド付加体形式を正常に検出するために、いくつかの手法が採用されていますが、本ビデオではそれらについて詳しく説明しません。例えば、フラットセルの使用は、セル密度が高くなるため、より高いスーパーオキシド付加体信号強度が得られる可能性があります。この件については、テキストを参照することをお勧めします。また、DMPOの代わりに、BMPOやVMPなどの認定済みのスピン トラップ、またはより持続性の高いSU過酸化物付加体を生成できるリン酸化Nitro DAP MPOを使用することも可能です。US検出のためにスピン トラッピングを用いる際、SU過酸化物付加体を安定化させるためにシクロデキストリンの使用も採用されています。SUスーパーオキシド生成後、直ちにEPスペクトルを取得することを強く推奨します。したがって、鉄MGDを用いた一酸化窒素の検出は非常に効率的であり、超酸素ラジカルのPRスピン・トラッピングにおける現在の主な課題は、鉄MGDの一酸化窒素付加体形成に見られる特性、すなわち、迅速な超酸素ラジカル反応性と安定した付加体の形成を実現することです。超酸素ラジカルに対して迅速に反応し、安定したスピン付加体を形成するスピン・トラップの開発に向けた取り組みが、現在当研究室および他の研究グループによって行われています。

detection-nitric-oxide-superoxide-radical-anion-electron-paramagnetic

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。...

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

スピントラッピングESR分光法は、植物抗酸化物質リコピン、タバコの煙のガス相フリーラジカルを捕捉に関するピクノジェノールとブドウ種子抽出物の効果を研究するために使用されていました。...

たばこの主流煙のフリーラジカルを検出し、気相を清掃するためのプロトコル

一酸化窒素（NO）の内因性産生は、生物多様な機能を調節する。それは、NOベースのシグナリングの中断または調節不全は、多くのヒト疾患に関与していることがますます明らかになりつつあります。関連するNOの代謝産物を定量化しないための方法は、ヒトの疾患の新しい診断または予後バイオマーカーを提供することがあります。...

一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法

この記事では、 顔を同時に検出し、細胞内の一酸化窒素（NO）とスーパーオキシドアニオン（O 2の可視化エンための蛍光色素ジアミノ-2ジアセテート（DAF-2DA）およびジヒドロ（DHE）を使用して適応が比較的容易な方法を記載しています.- ）は、それぞれ、肥満マウスモデルの新たに単離された無傷の大動脈です。...

無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出

新しい電子常磁性共鳴（EPR）法、高速走査EPR（RS-EPR）は、従来の連続波（CW）技術に優れており、in vivoイメージングのための新しい会場を開き、2Dスペクトル空間イメージングのために実証されています。結果は、250 MHzで実証されていますが、技術は、任意の周波数においても適用可能です。...

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。<em&gt;インビボ</em

電子常磁性共鳴 (EPR) 分光法は、フリーラジカルを測定する明確な方法です。選択的スピン プローブは、異なる細胞コンパートメント中のフリーラジカルの検出に使用します。治療、保存、および EPR...

周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

このプロトコルは、カプセル化されたヒト細胞を最大72時間生存可能に保つためのNMRバイオリアクターのセットアップを説明し、その後、時間分解された細胞内NMRデータ取得および分析を行う。この方法論は、細胞内のタンパク質-リガンド相互作用をリアルタイムでモニターするために適用されます。...

高細胞密度バイオリアクターを用いたリアルタイム定量細胞内NMRによるヒト細胞におけるタンパク質-リガンド相互作用のモニタリング

ここでは、化学発光ベースのアッセイを高感度に使用して、一酸化窒素およびその生物学的に関連する誘導体を検出するためのプロトコルを提示する。...

自動酸化およびニトロソ化化合物からの一酸化窒素およびその誘導体の検出のための化学発光ベースのアッセイ

ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。...

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

スーパーオキシドアニオンの生成は、血小板の刺激に不可欠であり、調節不全の場合、血栓性疾患にとって重要です。ここでは、スーパーオキシドアニオンの選択的検出と酸化還元依存性血小板調節の研究のための3つのプロトコルを紹介します。...

血小板中のスーパーオキシドアニオン生成を検出するための代替法 

学ぶ 一酸化窒素とスーパーオキシドラジカルの検出法。EPR分光法とスピントラップを用いて細胞から活性酸素種を検出する技術を習得し、神経科学や生化学研究への応用を理解できます。

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

さらに動画を探す