Name: レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で赤血球 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: 学ぶレンチウイルスを用いたTAL1ノックダウン法とヒト造血幹細胞からの赤血球分化プロトコル。サイトカインとストローマ細胞共培養による生体外造血機構の研究に応用可能。

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我々は、血液サンプルを提供するためL. DouayとMC Giarratana（大学パリVI、フランス） のex vivo赤血球分化についてのアドバイス、D.アランとH.アトキンス（オフジー、カナダの）感謝（オタワ病院研究倫理審査会で得られた＃ 2007804 - 01H）、批判的に原稿を読み取るためのレンチウイルスベクターとFJディルワース（オフジー、カナダ）を提供するためのD. Trono（エコール連邦工科大学ローザンヌ校）。このプロジェクトはMBCGPにCIHRの助成金（MOP - 82813）によって賄われていたオンタリオ州の研究基金計算Regulomicsトレーニングポストドクトラルフェローシップの受賞者です。 MBは遺伝子発現調節のカナダリサーチチェアを保持しています。

<ol><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
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<li>Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+human+stem+cell+factor%2Ferythropoietin-dependent+erythroid+progenitor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro.</a> Blood. 92, 3658-3668 (1998).</li>
<li>Lindern, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucocorticoid+receptor+cooperates+with+the+erythropoietin+receptor+and+c-Kit+to+enhance+and+sustain+proliferation+of+erythroid+progenitors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro.</a> Blood. 94, 550-559 (1999).</li>
<li>Freyssinier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((amplification+and+characterization+of+a+population+of+human+erythroid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors.</a> Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).</li>
<li>Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+red+blood+cell+production+from+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 91, 2664-2671 (1998).</li>
<li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li>
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<li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

メソッドの数は、成功の可変度と文化の中で赤血球系細胞を区別するために以前に使用されている。例えば、MS - 5上で共培養することなく一部のプロトコルは、赤血球系細胞の拡張を使用できますが、12月17日 、完全に成熟した除核赤血球の生産に効率的ではありません。他の方法が効率的に眼球摘出を可能にする一方で、それが増殖18,19を犠牲にしています。我々が最初にDouay研究室6で開発された、ここで使用されている方法は、（ゲノミクスおよびプロテオミクス研究のために必要な）赤血球分化の初期段階で細胞の増幅を長引かせるため、早期の前駆細胞の多数を提供してくれる最初の液体培養工程を、組み合わせたもの、およびヘモグロビンの合成を最大化すると赤血球の完全摘出を取得することが重要であるMS - 5間葉系細胞、上の共培養の第二段階。私たちのメソッドの2つの制限は、これまで完全に蛋白質のレベルと、このプロトコルを実行する2）高コストで、非常に初期の赤血球前駆細胞を特徴づけるために私たちを妨げている分化の初期段階での増幅の1）はまだ不十分な程度であり、特に大規模で。 <p class="j...

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

赤血球は細胞の分化を研究するために一般的に使用されるモデルシステムです。赤血球中に、多能性成体ヒト造血幹細胞（HSC）はoligopotent前駆細胞、コミットされた前駆体および成熟赤血球1に分化する。このプロセスは、付随して他の細胞タイプ2に固有の遺伝子を抑制する一方、特定の転写因子は、系統特異的遺伝子を活性化により、遺伝子発現のレベルでの大部分は規制されています。赤血球産生を制御する転写因子に関する研究は多くの場合、赤血球細胞が分化3-5の特定の段階で、ある程度、表現するヒトおよびマウス細胞株を使用して実行されます。しかし、形質転換細胞株は、部分的にしか赤血球系細胞を模倣することができますし、最も重要な、彼らは1つが理解しやすく、最終的な赤血球の運命に向かって多くの段階を経て細胞の進捗状況として発生する動的な変化を研究することはできません。したがって、現在の課題は、ゲノミクスおよびプロテオミクスの実験を行うのに十分な量で分化の様々な段階での主造血幹細胞と赤血球細胞の比較的均質な集団を得るために、プロトコルの開発のまま。 ここでは、臍帯血、骨髄、またはG - CSF（白血球搬出）を動員成人末梢血のいずれかから単離されたヒト造血幹/前駆細胞から赤血球分化を誘導するためにex vivoでの細胞培養のプロトコルについて説明します。最初にDouay研究所6によって開発されたこの培養系は、、骨髄の微小環境を模倣する間葉系細胞にサイトカインと共培養を使用しています。このex vivoの分化のプロトコルを使用して、我々は、赤血球前駆細胞の強力な増幅、排他的に赤血球系統と除核赤血球のステージへの完全な成熟に向かって分化誘導を観察。したがって、このシステムは、赤血球の系統に沿って造血幹細胞の進行など、転写制御の分子機構を研究する機会を提供しています。 転写レベルでの赤血球産生を研究することも主要な赤血球系細胞で過剰発現やノックダウン、特定の要因に能力を必要とします。この目的のために、我々は7分割し、非分裂細胞の両方を効率的に感染を可能にするレンチウイルスを介した遺伝子送達系を使用してください。ここで我々は効率的に初代ヒト赤血球系細胞における転写因子のTAL1をノックダウンすることができることを示している。さらに、GFPの発現は90％近くにレンチウイルス感染効率を示しています。従って、我々のプロトコルは、制御赤血球その転写因子の調節ネットワークの特性評価のための非常に有用なシステムを提供します。

アン<em&gt;生体外で</em&gt;プロトコルが記述されている造血幹/前駆細胞から成熟ヒト赤血球を生成する。さらに我々は、ノックダウン一次赤血球系細胞における転写因子のTAL1をするために効率的なレンチウイルスの配信方法を説明します。レンチウイルスによる遺伝子導入効率はGFP発現ウイルスを用いて示されています。

赤血球生成は、細胞分化を研究するために一般的に用いられるモデルシステムである。赤血球生成の過程において、多能性を持つ成人のヒト造血幹細胞は...

本手順の全体的な目的は、ヒト造血幹細胞および前駆細胞を赤血球系へと分化させ、ex vivoでの赤血球形成過程において特定の転写因子をノックダウンすることです。まず、臍帯血、骨髄、またはGCSFで動員された末梢血からCD 34陽性のヒト幹細胞および前駆細胞を単離します。次に、特定のサイトカインの組み合わせとストロマ細胞層上での共培養を用いて骨髄の微小環境を模倣した4段階の細胞培養手順により、これらの造血幹細胞を赤血球系へと分化させます。次に、標的となる転写因子に対するHRNA分子、陰性コントロールとしてのスクランブルHRA分子、およびウイルス感染効率を確認するためのGFPタンパク質を発現するレンチウイルスベクター粒子を調製します。手順の最終ステップは、分化の特定の段階にあるヒト原代赤血球系細胞にレンチウイルス粒子を感染させることです。最終的に、細胞形態の分析、前駆細胞のコロニー形成能、ヘモグロビンの産生、およびフローサイトメトリー（FACS）による赤血球特異的マーカーの発現解析を通じて、細胞増殖と赤血球分化を示す結果を得ることができます。ウイルス感染効率はFACSによるGFP発現の測定によって解析し、目的の転写因子のノックダウンはRT-qPCRによって解析します。本手法は、一次ヒト細胞によって提供される非形質転換環境における、各転写因子による遺伝子発現制御の分子メカニズムなど、造血分野における重要な課題の解明に寄与します。これは、分化決定、自己複製増殖、またはアポトーシスといった造血の基本的プロセスの理解にとって重要です。この手法は、正常な赤血球系細胞の分化（ROI）とその分子レベルでの制御に関する知見を提供できるだけでなく、真性多血症や骨髄増殖性新生物などの、不均衡、増殖、および分化に起因する疾患の標的治療を研究するためのモデルシステムとしても利用可能です。ヒト造血幹・前駆細胞からヘモグロビン含有成熟赤血球を体外で分化させるプロトコルは、CD34陽性ヒト造血幹・前駆細胞の分離と、無血清培地による細胞培養下での赤血球系分化の2つのステップで構成されています。ステップ1では、ポジティブ免疫選択法を用いて、臍帯血、骨髄、またはGCSFで動員したヒト末梢血からCD34陽性細胞を分離します。無血清赤血球分化の第2段階では、CD34陽性細胞を液体培養で増殖させます。DUラボで最初に開発された方法を適応させた4段階のプロトコルに基づき、0日目から11日目まで、造血細胞をヒドロコルチゾン、幹細胞因子、インターロイキン3、およびエリスロポエチンを添加した修飾ECCOs培地で培養します。その後、第3段階である11日目から15日目にかけて、赤血球系細胞をEPO含有添加IMDM培地中にてMS5間葉系細胞と共培養します。将来的に使用するために夏季赤血球系細胞を回収した後、残りの細胞を

lentiviral-mediated-knockdown-during-ex-vivo-erythropoiesis-human

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、shRNAレンチウイルスベクターの形質導入を行い、不死化造血幹細胞および前駆細胞(iHSPC)で安定したノックダウン細胞株を得る方法を示します。...

Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro:特定の遺伝子発現のノックダウンのためのレンチウイルスベースのshRNA発現システムのiHSPCへのデリバリー

私たちは、端末赤血球生成の初期および後期段階を解剖インビトロマウス胎児肝臓赤芽球培養系を提示。このシステムは、異なる発生段階における特定の遺伝子の機能解析を容易にします。...

マウス胎児肝臓培養システムは、ターミナル赤血球の初期および後期段階での標的遺伝子の機能を分析する

分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。...

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。...

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

ここで紹介は私達のプロトコルによる生産の赤芽球系前駆細胞 (投資事業組合) 転写因子駆動を用いたマウス アダルト繊維芽細胞からダイレクトリプログラミング系統...

リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。...

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

ここでは、shRNAのレンチウイルス伝達を用いて樹状細胞(DC)の開発に関与する潜在的な転写因子をスクリーニングするためのプロトコルを提供し、 インビトロ...

足骨造茎および前駆細胞株における短いヘアピンRNA媒介遺伝子ノックダウンによる樹状細胞の発達に関する研究

低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いて、H9ヒト胚性幹細胞(hESC)およびH9由来神経前駆細胞(NPC)においてshRNAを安定的に発現させるレンチウイルス粒子を高効率で製造しました。...

低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

赤血球生成のモデリングは、このプロセスにおけるアクターの生物学的意義を理解し、分化欠陥を緩和する可能性のある新しい治療アプローチを評価する貴重な機会を提供します。ここでは、ex...

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

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