Name: マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 15 s
Description: 学ぶマウス大動脈と外膜の免疫細胞フローサイトメトリー解析法。単一細胞懸濁液を調製し、蛍光標識で白血球サブセットを同定し、動脈硬化症における炎症メカニズムを解明する強力なツールです。

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PO1 HL55798（KLへ）とアメリカ心臓協会サイエンティスト開発グラント0525532U（例に）：この作品は、健康補助金の国立研究所によってサポートされていました。

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li>
<li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+in+atherosclerosis%3A+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+influx+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li>
<li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li>
<li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+%22mock%22+FL3+channel+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li>
<li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
<li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li>
<li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで、我々はマウス大動脈の免疫細胞組成の調査のためにフローサイトメトリーベースの手法を提案する。この方法の主な利点は、単一細胞レベルで大動脈免疫細胞を分析すると大動脈白血球の活性化状態を特徴づけるためにできることです。このメソッドは、マウス大動脈に限定し、我々 （未発表データ）と、他の10は、内胸動脈、大動脈弁、冠状動脈のような人間の標本を分析するためにこのアプローチを使用されていません。この方法の一つの制限は、単一の大動脈を回収したマウス大動脈の白血球の相対的に低い数字です。単一のアテローム性動脈硬化症大動脈から回収した白血球の数はフローサイトメトリーの実験のための十分ですが、存在量の低い細胞が単一の大動脈の細胞懸濁液中に検出することが困難な場合があります。必要に応じて、この問題は、フローサイトメトリー染色2-4大動脈から組み合わせのサンプルを使用することによって回避することができます。さらに、酵素処理は、表面抗原の発現に影響を​​与える可能性があるので、酵素処理への耐性は、関心のあるすべての抗原について決定する必要があります。我々は以前に酵素消化7による影響を受けない、いくつかの抗原マー...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料 </td><td> カタログ番号 </td><td> 会社 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼXI </td><td> C7657 </td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td> H3506 </td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td> DNアーゼI、タイプ2 </td><td> D4527 </td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>コラゲナーゼI </td><td> C0130 </td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>コラゲナーゼII </td><td> LS004174 </td><td>ワーシントン生化学株式会社</td></tr><tr><td>エラスターゼ</td><td> LS002292 </td><td>ワーシントン生化学株式会社</td></tr></tbody></table>

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

アテローム性動脈硬化症は、泡沫細胞、免疫細胞、血管内皮細胞と平滑筋細胞、血小板、細胞外マトリックス、および広範な壊死を伴う脂質の豊富なコアで構成されたプラークの形成を特徴とされる中規模および大規模血管の慢性炎症性プロセスのことです周囲組織の線維化1免疫応答の自然免疫と獲得武器がアテローム性動脈硬化の開始、開発と持続性に関与している。2、3、証拠の重要な体は樹状突起は、マクロファージなどの免疫細胞の異なるサブセットがあるリンクです。細胞、TおよびBリンパ球は、4健康とアテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスの大動脈内に存在する。さらに、免疫細胞がアテローム発生にこの組織の重要な役割を示唆している周囲の大動脈外膜に記載されています。2 当分の間、免疫細胞、それらの活性化状態、および大動脈壁内の細胞組成の異なる種類の定量的検出は、アテローム性動脈硬化症の研究のためにRT - PCRと免疫組織化学的方法によって限定されていました。いくつかの試みが、人間の大動脈を用いてフローサイトメトリーを実行するために作られた、そしてこのような高い自家蛍光などのさまざまな問題は、5,6を報告されている。人間のアテローム性動脈硬化プラークは、コラゲナーゼ1で消化した、と自由な細胞はCD14のために回収し、染色した+ / CD11cは+マクロファージ由来泡沫細胞を強調する。本研究では、&quot;モック&quot;チャネルは、偽陽性染色を避けるために使用された。消化の過程で蓄積する6壊死性物質は大動脈の試料で高い自家蛍光を発生する破片が大量に生じさせる。この問題を解決するには、陰性および陽性対照のパネルが提案されているが、唯一の二重染色は、これらのサンプルに適用することができます。我々は、免疫細胞組成を分析し、活性化、増殖、健康とアテローム性動脈硬化症を起こしやすい大動脈の免疫細胞の分化を特徴づけるために新たなフローサイトメトリーベースの方法7を開発した。このメソッドは、大動脈壁の免疫細胞組成の調査を可能にし、この病気の免疫的側面の調査のための免疫学的方法の広いスペクトルを使用する可能性を開きます。

本論文では、大動脈の免疫成分を調査するために、フローサイトメトリーベースの方法を提示。本稿では、また別々に周囲の外膜と血管壁を調べることができる追加のテクニックを示しています。このメソッドは、大動脈白血球の表現型解析を実行し、アテローム性動脈硬化症の研究のためにいくつかの免疫学的アッセイを適用する可能性を開きます。

動脈硬化は、中・大血管における慢性的炎症プロセスであり、泡沫細胞からなるプラークの形成を特徴とする。

本実験の目的は、フローサイトメトリーを用いて、大動脈および外膜に浸潤した白血球の組成と表現型を解析することです。まず、第2ステップとして動脈硬化大動脈を単離します。次に、大動脈から周囲の外膜を分離し、両組織から単一細胞懸濁液を調製します。次に、白血球の特定のサブセットを区別するために蛍光標識した外膜組織および大動脈壁からの単一細胞懸濁液の結果が得られ、動脈硬化形成過程における大動脈浸潤白血球の多様性と、単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー解析に基づいた大動脈外膜組織白血球の単離の実現可能性が示されます。免疫組織化学などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、1本の大動脈から、複数のマーカーを用いて白血球の検討および表現型解析が可能であることです。この方法は、動脈硬化症およびその他の血管炎症性疾患の病態生理における炎症の細胞介在因子に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。大動脈白血球の同定および、既存および新規の炎症メディエーターの表現型特性解析は、動脈硬化のメカニズムの解明に役立ちます。血液回収用の空の採取チューブと、PBSを含む採取チューブを氷上に準備します。回収する各大動脈について、安楽死させたマウスに70% ethanolを軽く塗布し、ラボテープを用いて解剖台に固定します。次に、ヘパリン処理したシリンジを用いて、心穿刺によりマウスから採血します。解剖用ハサミで腹腔と胸腔を開き、25ゲージの針を装着した10 mLシリンジを用いて、2%ヘパリン含有PBSで血管系を完全に灌流させます。続いて、腎臓、心臓、および大動脈はそのまま残し、内臓器官、生殖泌尿器、横隔膜、および脾臓を摘出します。大動脈組織内に血液が残っていないことを確認します。大動脈と外膜を傷つけないように注意しながら、脂肪組織と傍大動脈リンパ節を慎重に剥離します。その後、大動脈弓、および下行胸部および腹部大動脈を含む大動脈全体を回収します。単離した大動脈をPBSを入れた回収チューブに入れます。大動脈が入った回収チューブからPBSを除去します。大動脈に1倍濃度の外膜消化酵素溶液を2.5 milliliters加えます。次に、大動脈を酵素溶液中で37°Cで10〜20分間インキュベートします。インキュベートの間、ペトリ皿にPBSを加えます。インキュベーション後、部分的に消化された大動脈を酵素溶液からPBSを入れたペトリ皿に非常に慎重に移動させます。2組の曲鉗子を用いて、外膜組織層を大動脈から単一のユニットとして剥離します。外膜を完全に除去したら、外膜と大動脈を別々のファルコンチューブに移します。次に、1倍の大動脈解離酵素溶液を2.5 milliliters、大動脈と外膜にそれぞれ加えます。大動脈はより小さな断片に切断してもかまいません。酵素消化を促進するため、大動脈と外膜を37 °Cでさらに30分間インキュベートします。このインキュベーションの後、大動脈および外膜組織のチューブを氷上に置きます。70 µmのセルストレーナーとシリンジプランジャーを用いて残りの組織を剪断し、大動脈と外膜から単一細胞懸濁液を調製します。細胞懸濁液を5 mLのポリプロピレン製FACSチューブに移します。4 °Cで400 ×g、5分間遠心分離して細胞をペレット化します。1 mLのFACSバッファーで細胞を再懸濁し、トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞数をカウントします。酵素処理が表面抗原の発現に影響を及ぼす可能性があるため、脾臓の小片を酵素カクテル添加群および非添加群に分け、37 °Cで1時間インキュベートします。1時間後、フローサイトメトリーを用いて、解析対象の表面抗原発現に影響がないことを確認してください。適切な数の新しい実験用および対照用の固定用チューブにラベルを貼ります。目的の細胞外抗原に対する実験用および対照用の抗体カクテルを、別途ラベルを貼ったチューブに分注します。カクテルを入れたチューブを氷上に置き、蛍光色素を光から保護するために蓋をしてください。次に、5～8×10⁵個の大動脈および外膜細胞を、あらかじめラベル付けしたFACSチューブに分注します。各チューブに1 mLのFACSバッファーを加え、遠心分離して細胞をペレット化します。生細胞と死細胞を区別するため、デカンテーションによりペレット化した細胞から上清を除去します。まず、Live/Deadおよび固定死細胞染色キットを使用します。再溶解したLive/Dead染料1 µLを1 mLのPBSに加えてボルテックスで混合し、1× Live/Dead溶液を作成します。次に、実験サンプルおよびコントロールサンプルのチューブに、1× Live/Dead染料を100～200 µL加えます。その後、染料を加えたサンプルを室温、暗所で10分間インキュベートします。ライブ・デッド（生死判定）用コントロール試験管を56 °Cの暗所で10分間インキュベートし、熱ショックにより細胞を死滅させます。インキュベーション後、すべての細胞を1 mLのPBSで洗浄し、遠心分離により細胞をペレット化します。次に、各チューブに1 mLのfaxバッファーを加えて細胞を洗浄します。チューブをボルテックスして混合し、遠心分離により細胞をペレット化します。デカンテーションにより細胞から上清を除去します。100 µLのFCブロックを添加します。すべてのチューブにFaxバッファーを加え、緩やかにボルテックスして細胞を再懸濁させます。サンプルを室温、暗所にて10～15分間インキュベートします。次に、前述と同様に細胞を洗浄します。デカントして、細胞からSUP natumを除去します。対応するチューブに、適切な抗体カクテルを100 µLずつ加えます。軽くボルテックスして再懸濁します。20～30分間の細胞外染色後、ペレットを懸濁し、すべてのチューブを室温・暗所で20～30分間インキュベートします。前述と同様に細胞を2回洗浄し、上清を捨てて、ペレット化した細胞を300 µLの2%パラホルムアルデヒドで再懸濁し、フローサイトメーターで染色サンプルを解析します。TER19の結果は、大動脈細胞懸濁液で解析された白血球の大部分が、循環末梢血ではなく消化された血管由来であることを示しています。TER 1 1 9陽性の赤血球が、この代表的な大動脈細胞懸濁液中の細胞の18%を占めています。これは、大動脈細胞懸濁液から分離された細胞のうち、血液由来の細胞が0.02%未満であることを示しています。大動脈解離用酵素カクテルが細胞表面抗原に及ぼす影響を評価しました。ここで示されているように、この酵素カクテルはCD 45やCD 19の発現に影響を与えず、同様にCD 3 TCR、αβ TCR、γδ TCR、および本図には示していない他のいくつかの表面抗原についても影響はありませんでした。次の一連の図では、若齢のAPOE（アポリポタンパク質E）欠損マウス2匹の大動脈プールにおけるインターフェロンガンマ陽性T細胞の割合を決定するため、生存している大動脈CD 45陽性白血球をゲーティングしました。ここでは、白血球のみを分析するために、代表的なAPOE大動脈の前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のプロファイルが示されています。ここに見られるように、大動脈白血球をゲーティングするために、共通白血球抗原CD 45が使用されました。この図の大動脈白血球の前方および側方散乱光プロファイルにおいて、側方散乱光軸に沿って見られる小さな顆粒状の集団は、白血球ゲートに壊死細胞が含まれていることを示唆しています。これらの細胞を除去するため、生存白血球をゲートするためにLive/Dead Aquaを使用しました。その結果、この図に示される代表的な集団の最大30%が生存白血球であったことがわかりました。CD45陽性かつlive/dead陰性の前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）プロファイルに小型の非顆粒細胞が存在することは、CD45陽性live/dead陰性のゲート内に依然として細胞断片が含まれていることを示唆しています。ここに示されているように、解析にはサイズの大きい生存細胞のみが含まれるよう、多角形のFSC/SSCゲートを設定しました。CD45陽性live/dead陰性のFSC/SSC集団についてTCR αβおよびinterferon gammaを解析したところ、前述の一連の図と同様のゲーティングスキームを用いることで、生存している大動脈白血球の6%がTCR αβ陽性かつinterferon gamma陽性のTヘルパー1細胞であることが明らかになりました。12週間にわたり欧米型食餌を投与した2匹のAPOE nullマウスから得られた、CD68陽性CD11b陽性マクロファージおよびinterferon gamma陽性TCR αβ陽性細胞の代表的な細胞内染色データが、本図の予想通り、以下の図に示されています。欧米風食を摂取させたAPOE欠損マウスの大動脈。大動脈内の白血球の大部分はマクロファージであり、その40%がCD 68およびCD 11 Bの両陽性を示している。その他のCD 11 B陽性の骨髄系細胞は、同じ欧米風食摂取APOE欠損マウスの脾臓内における大動脈白血球集団の15%を占めている。生存しているSP細胞の7%がCD 11 B陽性かつCD 68陽性のマクロファージであり、10%がその他のCD 11 B陽性骨髄系細胞であった。対照的に、同様の染色を施した代表的なアイソタイプコントロールサンプルの図では、生存しているAPOE null細胞のうち、アイソタイプに対して偽陽性を示したのはわずか0.01%であった。さらに、西洋食を摂取させたAPOE nullマウスの12週以内において、TCR α、β陽性かつインターフェロンγ陰性のヘルパーT細胞およびインターフェロンγ産生TH1細胞が、大動脈浸潤T細胞および脾臓常在T細胞集団の大部分を占めている。この図のaovの検討に見られるように、アイソタイプコントロールで染色された細胞では、TCR αβ陽性かつインターフェロンγ陽性の細胞のうち、インターフェロンγに関して偽陽性となるのはわずか0.5%であることが示唆されます。フローサイトメトリー染色のために大動脈外膜を単離することの妥当性を示すため、ここでは大動脈および外膜組織の細胞懸濁液における代表的なCD45陽性白血球の染色結果を示します。浸潤したCD45陽性白血球は、外膜細胞懸濁液の約18%および大動脈細胞懸濁液の11%を占めていました。この手順を行う際は、特に指示がない限り、これらの試薬および細胞を氷上で遮光状態で保持することを忘れないでください。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリー実験に使用するための、大動脈および大動脈外膜からの単一細胞懸濁液の分離および調製方法について深く理解することができます。

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Immunology and Infection

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学ぶマウス大動脈と外膜の免疫細胞フローサイトメトリー解析法。単一細胞懸濁液を調製し、蛍光標識で白血球サブセットを同定し、動脈硬化症における炎症メカニズムを解明する強力なツールです。

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

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