Name: バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 学ぼう、バーコード酵母ライブラリーを用いた競争力のあるゲノム画面法。Candida albicans変異体を用いて遺伝子と薬剤の相互作用を並列解析し、機能ゲノミクス研究に応用する方法を解説します。

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我々は、議論や助言のためにトロント大学のロンデイビス、アダムDeutschbauer、および全体のHIP HOPの研究室に感謝します。 CNは、米国立ヒトゲノム研究所（助成番号HG000205）、RO1 HG003317、CIHR MOP - 84305、およびカナダの癌協会（＃020380）からの補助金によってサポートされています。 JOは、スタンフォードゲノムのトレーニングプログラム（米国立ヒトゲノム研究所から助成番号T32 HG00044）と国立衛生研究所（助成番号P01 GH000205）によってサポートされていました。 GGは、博士へのイノベーションのためのカナダの財団からの助成金によって部分的にサポートされているNHGRI RO1 HG003317とカナダの癌協会、グラント＃020380、TDとドネリーシーケンシングセンターによってサポートされています。ブレンダアンドリュースとジャックグリーンブラット。 AMSは、トロントオープンフェローシップの大学によってサポートされています。

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは、簡単にタグ付けされた変異体のコレクションを作成するためにさまざまな微生物のバーコード変異体コレクションの既存のコレクションの広い範囲に適合させることができる、ささやかな変更で、プロトコルを概説。我々は病原性酵母C.のタグトランスポゾン突然変異誘発のプロトコルを報告している間、我々はそれを強調するアルビカンス 、非常によく似たプロトコルは、単細胞の菌類の多様なに適応することができます。変更された、このプロトコルは、細菌13には適切に動作し、現在追加の真菌や細菌ゲノムの数のコレクションが建設中です。現時点では、このアッセイは、遺伝子-小分子の相互作用のための唯一の包括的な、ゲノムワイドな画面を提供します。アッセイの一つ、特に魅力的な機能は、遺伝子や低分子化合物の事前知識を必要としないことです。これらのアッセイの範囲とパワーにもかかわらず、他のラボへの譲渡は、結果の分析のための初期設備投資と情報ツールによって幾分妨げられてきた。分析のための堅牢なツールと組み合わせて次世代シーケンスの読み出しの採用により、我々は彼らの採用が増加すると予想。

<table border="1"><tbody><tr><td> 抗生物質 </td><td> ベンダーとカタログ番号 </td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>シグマ、一部＃C1613 </td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>シグマ、一部＃K1876 </td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td>シグマ、一部＃S0692 </td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>シグマ、一部＃C0378 </td></tr><tr><td> DNAクリーンアップと濃縮キット </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprepキット</td><td>キアゲン、一部＃27106 </td></tr><tr><td>ハイスピー​​ドプラスミドマキシキット</td><td>キアゲン、一部＃12663 </td></tr><tr><td> QIAクイックPCR精製キット</td><td>キアゲン、一部＃28106 </td></tr><tr><td> QIAquickゲル抽出キット</td><td>キアゲン、一部＃28704 </td></tr><tr><td> PCRと電気泳動試薬 </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNAポリメラーゼ（MG -フリー）バッファ</td><td>ニューイングランドバイオラボ、一部＃M0320L </td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド溶液のミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ、一部＃N0447L </td></tr><tr><td> 25 mMのMgCl 2の </td><td>シグマ、一部＃63036 </td></tr><tr><td>アガロース、ローディング色素、および核酸は、ゲル電気泳動に適した染色</td><td>様々な</td></tr><tr><td> 10X TAEバッファー</td><td>シグマ、一部＃T8280 </td></tr><tr><td> 1 KBプラスDNAラダー</td><td>インビトロジェン、一部＃10787026 </td></tr><tr><td> YPD培養液 </td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス10 gの</td><td>シグマ、一部＃Y1625 </td></tr><tr><td> 20グラムバクトペプトン</td><td> BDバイオサイエンス、一部＃211677 </td></tr><tr><td>デキストロース20gの</td><td>シグマ、一部＃D9434 </td></tr><tr><td> 実験機器 </td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット（1000、200、および20μL） </td><td>様々な</td></tr><tr><td>使い捨てピペット貯水池</td><td>様々な</td></tr><tr><td> 15〜50 mLの遠心管</td><td>様々な</td></tr><tr><td> 96 - と384ウェルディープウェルプレート</td><td> Axygen科学、一部＃P - 2ML - SQ - CS＆P - 384240SQCS </td></tr><tr><td> 96ウェルおよび384ウェルPCRプレートとシールのフィルム</td><td>様々な</td></tr><tr><td>マルチウェルプレートをシールするためのプレートのローラー</td><td>シグマ、一部＃R1275 </td></tr><tr><td> 30℃と37℃のプレート上に細菌や酵母の成長のために、チューブのインキュベーターを揺すって</td><td>様々な</td></tr><tr><td> in vitroでトランスポゾン変異誘発の </td><td></td></tr><tr><td> EZ - Tn5が知られトランスポザーゼ</td><td>シャーロットのバイオテクノロジー、一部＃TNP92110 </td></tr><tr><td> ハイスループット変換 </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HTプラスミドプレップキット</td><td>エッジバイオシステムズ、一部＃84359 </td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール、分子量3350 </td><td>様々な</td></tr><tr><td>リチウム酢酸</td><td>シグマ、一部＃517992 </td></tr><tr><td> 6ウェルプレート、滅菌</td><td>コー​​ニング、一部＃3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / mLのウリジン</td><td>シグマ、一部＃U3750 </td></tr><tr><td> 100Xトリス- EDTA緩衝液</td><td>シグマ、一部＃T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td>様々な</td></tr><tr><td>サケ精巣DNA </td><td>シグマ、一部＃1626 </td></tr><tr><td> バーコードのコレクションの成長 </td><td></td></tr><tr><td> 48ウェルプレート、プレート中で培養を成長した場合</td><td>グレイナー、一部＃M9437 </td></tr><tr><td>粘着板のシール</td><td> ABgene、一部＃AB - 0580 </td></tr><tr><td> 200mLの培養フラスコ</td><td>様々な</td></tr><tr><td>吸光度が可能な分光光度計</td><td>様々な</td></tr><tr><td> 250mlのフラスコや揺れ分光光度計用の温度制御シェーカー</td><td>様々な</td></tr><tr><td>セイフ - ロック微量遠心チューブに、2 mLの</td><td>エッペンドルフ、一部＃0030 120.094 </td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーション装置 </td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン640 </td><td>アフィメトリクス、一部＃800138 </td></tr><tr><td>搭載されたGeneChip流体駅450 </td><td>アフィメトリクス、部分＃00から0079 </td></tr><tr><td> GeneArrayスキャナ3000 </td><td>アフィメトリクス、部分＃00から0212 </td></tr><tr><td>フローティングラックと沸騰水浴</td><td>様々な</td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーションの消耗品 </td><td></td></tr><tr><td> Genflexタグ16K配列v2の</td><td> Affymetrix、一部＃511331 </td></tr><tr><td>デンハルト溶液、50倍濃縮</td><td>シグマ、一部＃D2532 </td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、R -フィコエリスリン共役（SAPE） </td><td>インビトロジェン、一部＃S866 </td></tr><tr><td>セイフ - ロックマイクロ遠心チューブ、0.5 mLの</td><td>エッペンドルフ、一部＃0030 123.301 </td></tr><tr><td>小さなタフスポット</td><td>多様なバイオテック、一部＃LTTM - 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td>バイオラッド、一部＃161-0729 </td></tr><tr><td> 10％のTween </td><td>シグマ、一部＃T2700 </td></tr><tr><td> MES遊離酸一水和物</td><td>シグマ、一部＃M5287 </td></tr><tr><td> MESのナトリウム塩</td><td>シグマ、一部＃M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaClを</td><td>シグマ、一部＃71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td>シグマ、一部＃S2015 </td></tr><tr><td>分子生物学グレードの水</td><td>シグマ、一部＃W4502 </td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーションのプライマー </td><td> 様々なサプライヤー（標準脱塩） </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5&#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5&#39;ビオチン- GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5&#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5&#39;ビオチン- GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5&#39;ビオチン- CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5&#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3&#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3&#39; </td></tr><tr><td> シーケンシングプライマー：イルミナのプラットフォーム </td><td> 様々なサプライヤー </td></tr><tr><td> UpTagフォワード（100uM） </td><td> 5&#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTagリバース（100uM） </td><td> 5&#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTagフォワード（100uM） </td><td> 5&#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTagリバース（100uM） </td><td> 5&#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3` </td></tr><tr><td> 1を読んUP -タグ配列のプライマー（100uM） </td><td> 5&#39;GTC GAC CTG C​​AG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> 1 DOWN -タグ配列のプライマー（100uM）をお読みください</td><td> 5&#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> 2インデックスシーケンスプライマー（標準イルミナR1のプライマー）（100uM）をお読みください</td><td> 5&#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> 追加のシークエンシング試薬/装置 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲンアプライ96 UF PCR精製キット</td><td>キアゲン、一部＃29051 </td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>任意のベンダー</td></tr><tr><td>マシュレ-ナーゲル真空マニホールド</td><td>マシュレ-ナーゲル、一部＃740 681 </td></tr><tr><td>インビトロジェンクワント- ITのdsDNA BRアッセイキット</td><td>インビトロジェン、一部＃Q32853 </td></tr><tr><td>インビトロジェン量子ビットのアッセイチューブ</td><td>インビトロジェン、一部＃Q32856 </td></tr><tr><td> 40％アクリルアミドプラス1％N、N&#39; -メチレン - ビス - アクリルアミド、37.5:1 </td><td>バイオラッド、一部＃161-0148 </td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>シグマ、一部＃T1503 - 1KG </td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ、一部＃B6768 - 500G </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA、pH8.0の</td><td> Teknova、一部＃E0306 </td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>シグマ、一部＃A3678 - 25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop、一部＃TEM001.25 </td></tr><tr><td>臭化エチジウム溶液</td><td> Bioshop、一部＃ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0.5M酢酸アンモニウム</td><td> Teknova、一部＃A2000 </td></tr><tr><td> 10mMの酢酸マグネシウム四水和物</td><td>シグマ、一部＃M0631 - 100G </td></tr><tr><td> 1mMのEDTA、pH8.0の</td><td> 0.5M EDTA、pHが8.0を参照してください。 </td></tr><tr><td>エタノール</td><td>様々な</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム、pH 5.2 </td><td> Teknova、一部＃S0297 </td></tr><tr><td>速度の真空</td><td>様々な</td></tr><tr><td>シングルリードクラスタ生成キット</td><td>イルミナ、一部＃GD - 300 - 1001 </td></tr><tr><td> v4の36Cシークエンシングキット</td><td>イルミナ、一部＃FC - 104 - 4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBEのレシピ<table border="1"><tbody><tr><td>額</td><td>試薬</td></tr><tr><td> 108グラム</td><td>トリスベース</td></tr><tr><td> 55グラム</td><td>ホウ酸</td></tr><tr><td> 40mlの</td><td> 0.5M EDTA（pH 8.0）を</td></tr><tr><td colspan="2"> 1LのマークにのdH 2 Oを追加</td></tr></tbody></table> 12％ポリアクリルアミドゲルのレシピ<table border="1"><tbody><tr><td>ボリューム</td><td>試薬</td></tr><tr><td> 5.8ミリリットル</td><td> 40％アクリルアミドプラス1％N、N&#39; -メチレン - ビス - アクリルアミド、37.5:1 </td></tr><tr><td> 12ミリリットル</td><td>のdH 2 O </td></tr><tr><td> 2ミリリットル</td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140μL </td><td> 10％の過硫酸アンモニウム</td></tr><tr><td>総量：20ミリリットル</td><td></td></tr></tbody></table>プライマーミックスをUptag： その後再懸Uptagと100μMでのddH 2 OでBuptagkanmx4それぞれ、50μMの各終濃度に対して1:1の比率で混合する。 -20℃で保存プライマーミックスをDowntag： 再懸​​DntagとBdntagkanmx4100μMでのddH 2 Oのそれぞれは、その後50μMの各終濃度に対して1:1の比率で混ぜる。 -20℃で保存混合オリゴヌクレオチド： 100μMでのddH 2 Oで次の8つのオリゴ（標準脱塩）のそれぞれを再懸濁します。 Uptag、Dntag、Uptagkanmx、Dntagkanmx、Uptagcomp、Dntagcomp、Upkancomp、Dnkancomp。 12.5μM各終濃度8つのオリゴヌクレオチドの等量を混ぜる。 12X MES在庫： 10ミリリットルの場合は、8ミリリットル分子生物学グレードの水に0.7グラムMES遊離酸一水和物と1.93グラムMESのナトリウム塩を溶かす。よく混合した後、pHをチェックし、pHを6.5から6.7に、必要に応じて調整します。 10ミリリットルの合計体積に水を追加。滅菌濾過し、4℃での光（例えば、ホイルで管を包む）から保護。解決策が目に見え黄色または6ヶ月後になった場合に交換してください。 2Xハイブリダイゼーション緩衝液： 50ミリリットルの場合は、12X MES株式の8.3ミリリットル（2.9.14から）、5 M NaClを、0.5 M EDTA、10％Tween 20を0.1 mlの（vol / vol）の4.0 mlおよび19.9ミリリットルのddHフィルタリングの17.7 mlを混ぜて2 O滅菌フィルタします。 ミックス300ミリリットル20X SSPE、1 mlの10％トゥイーン（vol / vol）の、699ミリリットルのddH 2 O：ウォッシュ滅菌フィルタします。 ウォッシュB：ミックス150ミリリットル20X SSPE、1 mlの10％トゥイーン（vol / vol）の、849ミリリットルのddH 2 O滅菌フィルタします。 バーコードシーケンシングプライマー UP -タグのプライマー配列の5&#39;末端には、（ 太字 ）FとRプライマーに組み込まイルミナ特定のアダプターの配列である。変数の配列（ イタリック体）インデックス/多重読み出しに使用される5 - merのインデックス作成のタグを表します。 3&#39;末端には（下線）uptagのバーコードを隣接の一般的なプライマーを表しており、酵母のバーコードを増幅するために必要です。 DOWN - tag内のプライマーは5しかし、3&#39;末端が（下線）を増幅するために使用される共通のプライマーで置き換えられる、UP -タグプライマー（イルミナ特定のシーケンス）の尾&quot;尾は5と同一である&#39;配列DOWNをタグのバーコード。

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

次世代シーケンシング技術の進歩のおかげで、我々は、ほぼ毎日新しいゲノム配列へのアクセス権を持っている。これらの進歩のテンポがより大きな深さと幅広さを約束し、加速しています。これらの飛躍的進歩を踏まえて、遺伝子の機能を定義するために、高速、並​​列メソッドの必要性がますます重要になります。酵母やE.におけるゲノムワイドな欠失変異体のコレクション大腸菌の遺伝子の機能の機能解析のための主力を務めているが、この方法はスケーラブルではない、現在の遺伝子欠失のアプローチは、ゲノムを構成する数千の遺伝子のそれぞれを削除し、検証する必要があります。この作業が完了した後にのみ、我々は、高スループットの表現型解析を挟むこともできます。過去10年間で、私たちの研究室では競争力のある、小型化、ハイスループットのゲノムワイドな並列実行できるアッセイのポートフォリオを改良しました。この並列化では、バーコードは、突然変異のプロキシとして機能しているためDNA&quot;タグ&quot;、または各変異体に&quot;バーコード&quot;を含めることが可能であり、1は変異型フィットネスを評価するためにバーコードの存在量を測定することができます。本研究では、我々はDNA配列やバーコード変異体コレクションの間のギャップを埋めるために求めている。これを達成するために我々は、新たに配列決定するまでのパラレルバーコードのアッセイを開きますが、悪い微生物を特徴とする複合トランスポゾン混乱 - バーコードのアプローチを紹介する。我々は新しいカンジダバーコード混乱のコレクションを発表し、どのように両方のマイクロアレイベースの、次世代シーケンシングベースのプラットフォームを記述するこのアプローチを説明するために10,000を集めるために使用することができます-一回の実験で1,000,000遺伝子-遺伝子と薬剤遺伝子の相互作用。

我々は包括的、公平なゲノムワイドな遺伝子薬剤と遺伝子 - 環境相互作用を理解するために画面を開発しました。これらの変異体のコレクションをスクリーニングするための方法が提示されます。

次世代シーケンシング技術の進歩により、ほぼ毎日、新しいゲノム配列が利用可能になっています。こうした進歩の速度は...

本実験の全体的な目的は、ゲノムワイドにバーコード化された微生物ライブラリを用いて、遺伝子と薬物、および遺伝子と環境の相互作用を高度に並列的な手法で解明することです。これは、ロボティクスを用いて細胞を対数増殖期に維持しながら、薬物存在下で微生物ライブラリを5世代から20世代にわたってスクリーニングすることで達成されます。第2段階として細胞を回収し、4,000から6,000個体のゲノムDNAを同時に抽出します。次に、増幅されたバーコードを含むPCR産物を、マイクロアレイハイブリダイゼーションまたはバーコードシーケンシングを用いて定量し、それによって複雑なプールにおける各株の存在量を決定します。最終的に、どのバーコード付き変異株が処理に感受性であり、その結果、実験過程でプールから減少しているかを示す結果が得られます。今日ご紹介する手法の主な利点は、菌株をプレート上のコロニーや個別の液体培養として個別に扱うのではなく、数十万から数百万の異なる菌株をまとめて一つのプールとして解析できる点にあります。このアッセイの有用性が明らかになったため、自動化する必要がありました。幸運にも、私はスタンフォードゲノムテクノロジーセンターに勤務しており、周囲にいたエンジニアたちの協力を得てこれを実現することができました。本日のプロトコルの実演は、私の研究室のシニア大学院生であるAndrew Smithが、すべてのプロトコルと関連手順を詳しく説明し、続いてTanya Durickがプロトコルのシーケンス工程について解説します。このプロトコルでは、トランスポゾン変異導入によって作製されたCandida albicans変異体ライブラリを使用します。各変異体にはバーコードタグが付与されており、個々の変異体を単一のプールにまとめることができます。ライブラリのコピーは3枚の84ウェルプレートに複製されます。培地を含むウェルプレートを用い、コロニーが最大サイズに達するまで30°Cで2〜3日間培養します。次に、火炎滅菌と滅菌済み器具を備えた微生物学的な環境下で、各トレイに5〜10 mLの培地を満たし、5分間浸漬させます。セルスプレッダーでコロニーを再懸濁し、細胞を含む液体を50 mLコニカル遠心チューブに移します。7% DMSOを添加します。7% DMSOを含む培地を用いて、細胞の最終OD 600濃度を50/mLに調整し、PCRストリップチューブに40 µLずつ分注します。プールした細胞の分注液は、-80 °Cで無期限に保存可能です。この手順を開始するには、プールした細胞の分注液を氷上で融解させ、直ちに選択した薬剤または条件下にある培地に緩やかに希釈し、48ウェルプレートの1ウェルあたり合計700 µLの容量で、OD 600が0.0625となるように接種します。本ビデオでは、2つの条件を3反復ずつ用意します。プレート上に、少なくとも1つの適切な溶媒コントロールを含めます。プラスチック製プレートシールでプレートを密封し、分光光度計または温度制御シェーカーを用いて、実験的に決定した振盪条件で30 °Cにて細胞を培養します。例えば、14分間振盪し、1分間ウェルを読み取った後、再び振盪を再開します。細胞懸濁液の一部をロボットで回収し、ロボットデッキ上のコールプレートに保存することができます。ユーザーが定義した世代時間（通常は5、10、15、20世代の増殖時）に回収を行います。各サンプルおよび時間点について、少なくともod 600が2に達する量の細胞を回収してください。回収した細胞サンプルをセーフロックマイクロ遠心チューブに移します。これらの細胞は、次に示すゲノムDNA抽出に使用できます。Yeast STARキットを用いて、さまざまな時点で回収した細胞から精製されたゲノムDNAです。製造元の指示に従い、1箇所の変更として300 µLの0.1 XTEを用いてDNAを溶出させます。次に、各サンプルについて、UPTタグ用とdownタグ用の2つのPCR反応を準備します。得られたPCR産物をゲルで確認します。レーン1および3に示されているハイブリダイゼーションに使用されるアンプリコンの場合、どちらのPCRにおいても60 bpの産物が得られることが予想されます。この例では、レーン5および7に示されているバーコードシーケンシング用のアンプリコンについては、130 bpの産物が得られることが予想されます。この時点で、生成されたPCR産物の種類に応じて、マイクロアレイ解析またはダイレクトバーコードシーケンシングに使用することができます。マイクロアレイ解析の準備として、ハイブリダイゼーションオーブンの温度を42 °Cに予熱し、沸騰水浴と氷水スラリーを入れたアイスバケットを準備します。1x ハイブリダイゼーションバッファー120 µLをゆっくりと満たし、アレイを事前的に濡らしておきます。アレイをハイブリダイゼーションバッファー中で42°C、20 RPMで10分間インキュベートします。インキュベートしている間に、ロックトップの0.5 mLチューブに120 µLのハイブリダイゼーションミックスを分注します。サンプル数に1つ余裕を持たせて各チューブに調製してください。このハイブリダイゼーションミックスに、アップテイクPCR産物を30 µL、ダウンタグPCR産物を30 µL加え、最終容量を150 µLにします。2分間煮沸し、少なくとも2分間氷水で冷却します。使用前にチューブを軽く遠心分離します。アレイから前ハイブリダイゼーションバッファーを取り除き、蒸発を防ぐために120 µLのハイブリダイゼーションPCRミックスを加えます。アレイのガスケットをtough spotで覆い、42°C、20 RPMで16時間ハイブリダイゼーションを行います。ハイブリダイゼーションオーブンからアレイを取り出し、チップからtough spotを取り除きます。ピペットを用いてアレイからハイブリダイゼーション混合液をゆっくりと除去し、アレイを満たします。120 µLの洗浄液Aを用いて、準備済みのフルイディクスステーションのウォッシャーにアレイをロードします。アレイはgene Flex SV 3 4 50プロトコルに従って洗浄しますが、染色前に洗浄液Aによる工程を1回追加するという変更を加えます。洗浄Bの温度を40°Cではなく42°Cにし、フルイディックステーションでの染色は25°Cではなく42°Cで行います。フルイディック操作に続き、フルイディックステーションを作動させ、four 50プロトコルを終了します。気泡がないことを確認した後、ウォッシャーから取り出してください。アレイをスキャナーにセットし、放出波長560 nanometersでスキャンします。130 base pairのPCR産物を次世代バーコードシーケンシングに使用するため、まず12%ページゲルを用いて12個のプールDNAサンプルを分離します。次に、ゲルをCyber Greenで染色し、目的のゲルバンドを切り出します。その後、ゲルから抽出したDNAをリアルタイムPCRで定量し、CBOTおよびシングルリードクラスター生成キットを用いて、シングルリードフローセル上にクラスターを生成します。フローセルをシーケンサーにロードし、最初の塩基が検出されることを確認します。ここに示されているシーケンサーは代表的なものであり、データはプロトコルの特定の時点で収集したものです。タグ付けされた変異株のプールを、抗真菌剤であるクロトリマゾールの存在下およびコントロールとしてDMSO存在下で20世代にわたって培養し、各遺伝子のlog2比を算出してプロットしました。log2比が2であり、クロトリマゾール処理に対して有意に感受性を示すすべての株を赤色でハイライトしています。この例では、NCP1、ERG2、およびERG11の2つの独立したアレルを含む4つの株を示しています。プールスクリーニングで感受性ありと検出された、抗真菌薬クロトリマゾールの既知の標的タンパク質を持つ株について、同濃度の薬剤存在下での個別の増殖アッセイにより、その感受性を検証する必要があります。次のグラフは、ここでの確認実験の結果を示しています。スクリーニングで検出された4つの株は、野生型の親株と比較して増殖が低下していました。黒色で示されているのがBWP 17である。これらの個別の増殖曲線は、このようなプールされた遺伝子薬剤スクリーニングにおける重要な特徴を浮き彫りにしている。それは、特定の株の絶対的な順位が、必ずしもその正確な感受性レベルを反映しているとは限らないということである。さらに、これらの結果は、各遺伝子に対して複数のアレルを持つことの有用性を示している。この例では、2つの ERG 11 破壊変異体で薬剤に対する感受性がわずかに異なります。習得すれば、適切に実施することで、スクリーニングの接種からデータ解析までを5日間で完了させることができます。したがって、個々の実験は生物学的な知見をもたらしますが、真の有用性は、多くの実験を行いデータベースを構築することで、遺伝子機能や薬剤作用を予測できるようになる点にあります。このビデオを視聴することで、プールスクリーニング用のゲノムワイド・バーコード変異体ライブラリの調製方法、および調製後にマイクロアレイまたはシーケンシングを用いて標的遺伝子を同定する方法について十分に理解することができます。この技術の開発により、機能ゲノミクス分野の研究者は、酵母ゲノムに含まれる6,000種類の異なる遺伝子それぞれの機能を探索することが可能になりました。

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