シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

本手順の全体的な目的は、単体のdrosophilaまたはmatiaを解剖およびイメージングし、神経変性モデルにおける細胞内イベントを研究することである。これは、まずハエの頭部を身体の残りの部分から切り離し、それを切り開くことで達成される。

次に、頭部内から脳およびその他の組織を取り除きます。その後、クチクラを除去し、各網膜を半分に切断します。手順の最終ステップとして、タングステン針を用いてOmmatidiaを切り出し、スライドガラス上に配置します。

最終的に、蛍光共焦点顕微鏡を用いて細胞質内のオートファジー小器官を示す結果を得ることができます。この手法の主な利点は、これまで遺伝学的な知見しか得られなかった神経変性のショウジョウバエモデルにおいて、高解像度の細胞生物学的解析が可能になることであり、これにより手順の多様性が実証されます。本手順は、当研究室の大学院生が、センターの組織学および顕微鏡技術者であるDaniel Mackayの協力を得て実施しました。

まず、3ウェルガラススライドの1つのウェルにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を満たし、二酸化炭素でショウジョウバエを麻酔します。ハエが麻酔されたら、ピンセットで1匹のハエを摘み、PBSを入れた小さなディッシュの中に落とします。解剖顕微鏡下で、ピンセットで口器を挟み、首の部分を切断して頭部を体から切り離します。

2本目のピンセットで口器からハエの頭部を保持し、マイクロシザーを用いて外側吻側正中線に沿って頭部を半分に切断します。脳を露出させるため、カットしたピペットチップで頭部を持ち上げ、網膜を付着させてSchneider mediumを満たした別のウェルに移します。ピンセットで頭部クチクラの大部分を剥がし、その後、脳を取り出します。

網膜をラミナと角膜で挟んだままにします。次に、網膜を50 µLの新鮮なSchneider mediumの液滴に転移させます。グラススライド上に直接置き、マイクロ鋏を用いて、網膜の最背側または最腹端をピンセットで把持します。

背腹正中線に沿って網膜を半分に切り、眼の中央にあるAMIAを露出させます。角膜が下を向き、ラミナが上を向くように網膜を保持し続けます。細いタングステンの針を用いて、まずラミナからoiaを剥離し、次に角膜から剥離します。

単一のOIAおよびOIAの集団は、ウェルまたはスライドの底に集まります。次へ進む前に、集まった大きなデブリを除去してください。オートファジーを解析するには、LysoTrackerをSchneider mediumで1:1000に希釈して1滴加え、10秒間待ちます。

スライドから余分な液体を取り除きます。この際、AMIAが失われないように注意してください。AMIAを覆うように、Vector Shieldを1滴加えます。

カバーガラスを載せてネイルポリッシュで封印し、共焦点顕微鏡で観察します。atropinの変異体を発現するハエから解剖した単一のtarsomereにおいて、GFP-ATG8で標識されたオートファゴソームとLysoTrackerで標識されたリソソームの両方を可視化できます。右上の明視野パネルには、ほぼ完全な形状を維持したtarsomereの構造が表示されており、枠で囲まれた部分がスキャン領域を示しています。ここでは、赤色がリソソームを、緑色がオートファゴソームを表しています。

2つのオルガネラの融合によって形成されるオートリソソームは、黄色に見えます。この手順に続いて、材料の培養や薬剤投与などの他の手法を行うことで、異なる疑問に対する検証が可能です。例えば、異なる遺伝的背景を持つ神経細胞におけるオートファジーマーカーに対する有効化合物の検討などが挙げられます。

ショウジョウバエの遺伝学的な利点と、細胞培養で可能な高度な細胞生物学的解析を組み合わせます。