シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

この手順の全体的な目標は、細胞内イベントを研究するために、単一のショウジョウバエまたはマティアを解剖して画像化することです。神経変性モデルで。これは、最初にボディの残りの部分からフライヘッドを取り付け、それを切断して開くことによって達成されます。

次に、脳やその他の組織が頭の中から取り除かれます。次に、キューティクルを切除し、各網膜を半分に切断します。手順の最後のステップは、タングステン針でOを切り取り、スライドに堆積させることです。

最終的には、蛍光共焦点顕微鏡法により、細胞質のオートファジー性オルガネラを示す結果を得ることができます。この技術の主な利点は、これまでこの分野でしか遺伝的洞察を提供できなかった神経変性のためのショウジョウバエモデルにおける高解像度の細胞生物学的分析を可能にすることであり、手順が可変であることを示しています。私の研究室の大学院生で、センターの組織学および顕微鏡検査の技術者であるダニエル・マッケイの助けを借りています。

まず、3ウェルのスライドガラスの1ウェルにリン酸緩衝生理食塩水を入れ、次にハエに二酸化炭素を麻酔します。ハエに麻酔をかけたら、鉗子を使用して1匹のハエを拾い上げ、PBSの小さな皿に落とします。解剖スコープの下で、鉗子でプロボスをつまみ、首を切断して頭を体から切り離します。

プロボスからハエの頭を保持している2番目の鉗子のセットを使用して、マイクロハサミで外側吻側正中線に沿って頭を半分に切ります。脳を明らかにするには、カットしたピペットチップを使用して頭を持ち上げ、網膜を取り付け、シュナイダー培地で満たされた別のウェルに移します。鉗子で頭のキューティクルの大部分を剥がし、脳を切除します。

網膜を椎弓板と角膜の間に挟み込みます。次に、網膜を50マイクロリットルの新鮮なシュナイダー培地に移します。スライドガラスに直接置き、マイクロハサミを使用して鉗子で網膜の最も背側または腹側の端をつかみます。

背側腹側正中線に沿って網膜を半分に切開し、目の真ん中にAMIAを露出させます。角膜が下を向き、椎弓板が上を向くように網膜をつかみ続けます。細いタングステン針を使用して、最初にオイアをラミナから、次に角膜から取り外します。

単一のOIAとOIAのグループは、井戸またはスライドの底に集まります。続行する前に、溜まった可能性のある大きな日中の息をすべて取り除いてください。オートファジーを分析するには、Litoトラッカーをシュナイダー培地の1滴で1〜1000に希釈し、10秒間待ちます。

スライドから余分な液体を取り除きます。AMIAを置き去りにするように注意してください。アミアを覆うためにベクトルシールドを一滴追加します。

共焦点顕微鏡を使用してマニキュアでカバーを塗り、スリップしてシールすると、g fp a TG 8でマークされたファゴソームとlyo Trackerでマークされたリソソームの両方が、アトロピンの突然変異型を発現するハエから解剖された単一の退屈で視覚化できます。右上の明視野パネルには、退屈な部分のほぼ無傷の構造が表示され、フレームはスキャンされた領域を示しています。ここで、赤はリソソーム、緑はオートファゴソームを示します。

2つの細胞小器官の融合から生じる自動リソソームは黄色に見えます。この手順に続いて、材料の培養や薬物投与などの他の方法を実行して、さまざまな質問に答えることができます。例えば、異なる遺伝的背景を持つ神経細胞のオートファジーフラグに有効な化合物が見られます。

ショウジョウバエの遺伝学の利点と、細胞培養で可能な高度な細胞生物学的解析を組み合わせる。