口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。

この手順の全体的な目標は、舌への腫瘍浸潤の視覚化と定量化を可能にする口腔がんのマウスモデルを作成することです。これは、最初に、生命Act Mチェリーのレンチウイルス感染と安定したクローン選択による2光子イメージング用の口腔扁平上皮癌細胞を生成することによって達成されます。次に、同所性異種移植腫瘍は、麻酔をかけたマウスの舌に生命Act Mチェリー標識細胞を注射することにより、ヌードマウスで産生されます。

次に、腫瘍を含む舌を2光子顕微鏡で画像化します。最終的には、新鮮な舌組織の 2 光子イメージングとその後のコンピューター支援による原発腫瘍と局所浸潤細胞群の 3 次元再構築を通じて、舌筋内の局所口腔腫瘍浸潤を定量化した結果を得ることができます。この手法が免疫組織化学や生物発光イメージングなどの既存の方法よりも優れている点は、腫瘍細胞の浸潤を3次元で定量的に測定できることです。

この技術の意味は、腫瘍浸潤に関与するタンパク質の分析のためのモデルシステムを提供するだけでなく、抗侵襲的治療戦略に関する前臨床化合物の評価を提供するため、治療介入口腔がんにまで及びます。一般に、この技術に不慣れな個人は、腫瘍細胞の舌への注射と2つの写真顕微鏡検査のための舌の準備が技術的に要求され、スキルと練習が必要であるため、苦労するでしょう。2つの光子ステップでの腫瘍注射は習得が難しく、培養を開始するには専門的なスキルが必要なため、この方法の視覚化は重要です。

10%FBS、1%ペニシリンストレプトマイシン、および1%非必須アミノ酸を補充したDMEMからなる完全な培地中のヒト頭頸部腫瘍細胞株。LIFE Act Mチェリーコーティング配列をPLL 7.0レンチウイルスベクター部位に転写するためには、まず、親mCherry CD NAの1つの認識部位であるSBFに3つのサイレント変異を導入する必要があります。次に、PCRは、ECO R、1、SBF、1つの部位に隣接して、Modified Life Act mCherry配列を増幅し、PLL 7.0にサブclentします。レンチウイルス発現系培養に続いてPLL 7.0 LIFE Act Mチェリーコンストラクトを生成するために、パッケージング細胞株2 9 3 T 17〜40%コンフルエンスを完全培地で。

Cal Fossを使用して、PLL 7.0、LIFE、Act M、Cherry、PS、PACS、2、およびP-V-S-V-Gベクターをそれぞれ3対2対1の比率で細胞にトランスフェクションします。24時間後、培地を新鮮で完全な培地と交換し、培地を12時間ごとに72時間収集して補充し、収集した培地を摂氏4度で保存して、安定した寿命のActMチェリー発現を持つ頭頸部細胞株を作製します。収集した培地を2000RPMで摂氏4度で10分間回転させ、ウイルスを含む清澄化された培地1ミリリットルをOSC 19またはUS CCC one cellsに12時間加えます。

細胞をすすぎ、さらに1ミリリットルのウイルスを12時間追加します。pur mycinのミリリットルあたり200ミリグラムを含む培地で細胞を2週間培養する耐性コロニーを選択するために、生涯にわたって生き残ったコロニーを視覚的にスクリーニングしました。蛍光顕微鏡トリプシン眼によるアクトmチェリー発現、滅菌3ミリメートルクローニングディスクを使用した個々の陽性コロニー。

凍結するまでpur mycinのミリリットルあたり200ミリグラムを含有する培地で陽性細胞を維持するか、または同所性腫瘍異種移植トリプシン生命法を生成するための同所性注射に使用されます。腫瘍細胞を27ゲージのハーフインチ針に取り付けられた1ミリリットルの注射器にロードします。

次に麻酔をかけ、生後8週間の雌の無脊椎動物性キツネ。ケタミン1キログラムあたり80ミリグラムとキシラジン1キログラムあたり10ミリグラムの組み合わせを持つ1匹のヌードマウス。動物の動きが止まったら、目の潤滑軟膏を塗り、指の爪をフットパッドに押し込んで反応を確認します。

マウスを摂氏37度から40度の間の加熱パッドに維持します。滅菌鉗子を使用して、舌の先端をそっとつかみ、口腔から引き出します。細胞を各舌の片側にゆっくりと注入して、舌の中心に球根状の塊を作ります。

マウスにyohi beingのキログラムあたり2.1ミリグラムを注入し、麻酔からの回復中にマウスを監視するために加熱パッドに戻します。マウスを柔らかいトランスジェニック生地食を含む滅菌ケージに入れます。マウスの体重を2〜3日ごとに測定し、腫瘍の発生を視覚的に監視します。

ex vivoイメージング用のマウス舌を調製するには、異なる時点で腫瘍を有するマウスを安楽死させます。二酸化炭素を吸入して舌を取り出し、1つのXPBSですすいでください。次に、地元のホビーショップのモノフィラメントミシン糸とサイズ8のミシン針を使用します。

従来のパラフィン組織包埋カセットの片側に舌を取り付けます。舌が固定されたら、カセットアセンブリ全体を1つのXPBSに浸します。すぐに2光子顕微鏡で舌を処理し、2光子顕微鏡で舌を画像化します。

XPBSを1個入れた60mm皿に舌カセットを沈めます。2光子顕微鏡の対物レンズの下に配置された格納式カンチレバーアームのカスタムデザインホルダーに皿を固定します。40 x 0.8 の開口数水浸対物レンズを、目に見える腫瘍病変の上または上に直接置きます。

強度60ミリワット、入力波長755ナノメートルのチタンサファイアレーザーを用いた2光子顕微鏡で舌を画像化します。M cherry シグナルを最適化するには、15 マイクロメートルから 100 マイクロメートルの組織深さ全体にわたって、1 マイクロメートルの増分深さで 1 マイクロメートルのレーザー スキャン画像を連続して収集します。この構成では、組織の深さが最大1ミリメートルの腫瘍を分析できます。

スキャン画像を使用して画像をキャプチャします。スキャンイメージは、XYガルバンメトリックスキャンミラーを制御するためにラスタースキャンパターンの2チャンネル出力を生成すると同時に、データ収集ボードを介して光増倍管から同時に入力される最大4チャンネルの信号をキャプチャします。スキャン画像は、対物レンズのZ軸を制御することによりZスタック画像を収集し、シングルモードまたはサイクリックモードでタイムラプス画像を収集します。

画像を 16 ビット深度の 1 つの TIF ファイルに保存します。Amiraソフトウェアを使用すると、Zsスタック画像のセットを含むTIFファイルを開くことにより、腫瘍画像スタックを単一の3次元画像にレンダリングします。TEX 関数を使用して、3 次元レンダリングを生成します。

レンダリングされた画像には、いくつかの小さな解離した浸潤性グループ(igs)を含む大きな原発腫瘍画像が存在する可能性があります。腫瘍の体積を測定するには、原発腫瘍領域の閾値を定義し、画像スタックの各スライスをバックグラウンド蛍光を補正して除去します。侵襲的グループごとにしきい値処理手順を繰り返します。

原発腫瘍とすべてのigsを選択したら、原発腫瘍の体積測定値とX、Y、およびZ腫瘍OID座標を決定します。腫瘍中心点からigsの距離を計算するには、n nt x VT x dt に等しい ti を使用して腫瘍侵襲指数または ti を計算します。ここで、NTは画像内のigsの総数に等しく、VTはすべてのigsの総体積に等しく、DTは原発腫瘍の中心からすべての浸潤群が移動した総距離に等しくなります。

元の16ビットモノクロチップファイルをソフトウェア内のニコンNIS要素にインポートすることで、より詳細な地形の3次元レンダリングを生成できます。イメージ スタックから ND ファイルを作成します。次に、ドキュメントを手動でキャリブレーションして、より高品質のレンダリングのためのピクセルサイズを指定します。

Z 平面にスライスを追加します。この図は、2 光子像 NIS 素子またはミラーから取得した生データの例を示しています。この図に示すように、ソフトウェアを使用して舌腫瘍の生データを再構築できます。

このパネルは、Amira ソフトウェアの TEX 関数を使用した 3 次元レンダリングの例を示しています。これは、原発腫瘍および原発腫瘍中心またはoidからの浸潤群を特定するために、画像スタックから個々の2光子切片を閾値化する例です。各閾値セクションが分析された後、AmiraはCentroから各侵襲グループが移動した体積と距離を定量化します。

これらのデータはグラフィカルに示し、腫瘍細胞の浸潤の全レベルの数値を取得するために使用できます。ここに示されている一次部位に起因するのは、記載されたプロトコルを用いて類似の腫瘍の3次元画像と比較して、従来の病理学的免疫組織化学ラベリングによって視覚化された腫瘍の代表的な画像であり、舌摘出の時点から最終的な3Dレンダリングまで習得すると、この手順を試みながら適切に行えば、この技術は、約2時間で行うことができる。 針で舌を穴を開けて腫瘍細胞を失い、腫瘍の採取を妨げないように注意してください この手順に従ってください。治療用化合物やタンパク質レベルを操作した細胞の試験を行い、口腔がんの浸潤に対する有効性を判定することができます。

in vivoの設定では、レンチウイルスで修飾されたヒト腫瘍細胞での作業は、適切なPPEなどの危険な予防措置であり、BSLでの作業は、注射されたマウスで作業する際には常にBSL2認定の層流フードを着用する必要があることを忘れないでください。