Name: 口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶ口腔扁平上皮癌のマウスモデルにおける腫瘍浸潤の可視化と定量化の手法。二光子顕微鏡を用いて舌内の腫瘍細胞浸潤を三次元的に解析し、抗浸潤性化合物の評価に応用する。

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NIHの助成金P20 RR16440のサブプロジェクトと研究と大学院教育のウェストバージニア大学のオフィスからS.ウィードへのブリッジの助成金によってサポートされています。プロジェクト開発の初期段階におけるL.ロペス-スキナーからの技術支援を感謝する。 P.ターナーとK.セクレスト（ウェストバージニア大学部の、作者はまた、テクニカルサポートおよびJ.マイヤーズとM. Younesさん（頭頸部外科、MDアンダーソンがんセンター、ヒューストン、テキサス州）からOSC19細胞に感謝しています組織学的処理と手順については、病理組織バンク）、pLL7.0レンチウイルスベクターのためのLifeAct - mCherry構造とJ.ベア（ノースカロライナ大学）のためのR. Wysolmerski（ウェストバージニア大学、神経生物学と解剖学講座）。ウェストバージニア大学の顕微鏡イメージング施設（NIHの助成金P20 RR16440とメアリーバブランドルフがんセンターでサポートされている）とその非線形光学顕微鏡の実験室（NLOMの使用、神経科学のためのウェストバージニア大学センターとの間のジョイントコラボレーションによってサポートされていると物理学/ウェストバージニア州ナノイニシアティブのウェストバージニア大学部）にも感謝です。 NLOMは、神経科学のためのセンターにNIHの助成金P30 RR031155によって部分的にサポートされています。

1。細胞株、ベクターの構築およびレンチウイルス生産<ol><li>人間の頭頸部の腫瘍細胞株は、（OSC19またはUMSCC1）10％ウシ胎児血清FBS（Hycloneの猫＃SH30070.03）、1％ペニシリンを添加した（Cellgroの猫＃50 - 003 - PB）DMEMから成る、完全な培地で培養された/ストレプトマイシン（Cellgroの猫＃30 - 002 - CI）、および1％非必須アミノ酸（Cellgroの猫＃25 - 025 - CI）。 </li><li> pLL7.0レンチウイルスベクターにLifeAct - mCherryコード配列を転送するには、cDNAの親mCherryでSbf1認識部位は、部位特異的突然変異誘発（ストラタジーン社製の猫＃200518〜5）を使用して、認識配列に3つのサイレント変異を導入することによって変更されました。その結果修正されたLifeAct - mCherryのシーケンスは、PCRはEcoR1/Sbf1サイトに隣接して増幅し、pLL7.0 - LifeAct - mCherry構築を生成するためにpLL7.0にサブクローニングした。 </li></ol> 2。 pLL7.0 - LifeAct - mCherryのウイルス産生<ol><li>ウイルス産生は、レンチウイルス発現システムマニュアル（システムバイオサイエンスバージョン2から051018）に基づいて行われました。 </li><li>パッケージング細胞株293T/17細胞（ATCCカタログ番号CRL - 11268）HNSCC線に使用したのと同じ完全培地中40％コンフルエンスまで増殖させた。 </li><li>細胞はそれぞれ（クロンテックの猫＃631312）CalPhosを使用して、pLL7.0 - LifeAct - mCherry、psPAX2、そして3時02分01秒の比率でpVSV - Gベクターをトランスフェクションした。 </li><li> 24時間後、トランスフェクションからの最初のメディアは、新鮮な培地に交換した。 </li><li>メディアは、その後回収と補充、12時間ごとに72時間、4℃で保存した</li></ol> 3。安定LifeAct - mCherry発現と頭頚部の細胞株の産生<ol><li>収集されたメディアは、4℃で10分間2000rpmで回転させた℃で</li><li>ウイルスを含む明らかにメディアの一mlを直接12時間OSC19またはUMSCC1細胞に添加した。次いで、細胞をリンスした、とウイルスの追加の1枚のMLは、別の12時間内の追加されました。 </li><li>細胞は耐性コロニーを選択するために2週間200mg/mlピューロマイシンを含む培地で処理した。 </li><li>生き残ったクローンは、蛍光顕微鏡でLifeAct - mCherry発現のために視覚的にスクリーニングした。個々の陽性コロニーを滅菌した3ミリメートルクローニングディスク（フィッシャーの猫＃0790710A）を使用してtypsinizedした。 </li><li>陽性細胞は、バック凍結または同所性注入に使用するまで200mg/mlピューロマイシンを含む培地で維持した。 </li></ol> 4。同所性腫瘍異種移植片の形成<ol><li>すべての動物の手順は、ウェストバージニア大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコール（09〜0821）に準拠して実施された。 </li><li> LifeAct - mCherry発現する腫瘍細胞は、トリプシン処理、遠心分離し、2.5 × 10 4個の細胞を50μL完全培地に再懸濁したれた。 </li><li>腫瘍細胞は27 ½ゲージの注射針に接続された1ミリリットルの注射器に充填した。 </li><li>女性の無胸腺Fox1 nu / nuマウス8週齢（ハーランラボラトリーズは）ケタミン及び10mg/kgより少ないキシラジンを80mg/kgの組み合わせで麻酔した。麻酔したマウスは、加温パッドに37〜40 ° Cの間で維持された。 </li><li>滅菌ピンセットを用いて、舌の先端を穏やかに把握し、慎重に口腔内から引き出された。 </li><li>細胞は徐々に舌動脈を避けて、舌の中心部に球根状の塊を作成するために、各舌の片側に注入した。 </li><li>マウスは、2.1mg/kgのヨヒンビンを注入し、それらが麻酔からの回復中に2〜3時間のために監視されたヒーティングパッドに戻された。 </li><li>一度復活、マウスはソフトトランスジェニック生地の食（Bioserveの猫＃S3472）を含む滅菌ケージに入れた。 </li><li>マウスは2〜3日ごとに秤量して、腫瘍の発症のために視覚的にモニターした。 </li></ol> 5。 生体外イメージングのためのマウスの舌の準備<ol><li>異なる時点（通常は2週間から4週間後の注射）で腫瘍を保有するマウスは、二酸化炭素の吸入によって安楽死させた。 </li><li>舌は、抽出1X PBSでリンスし、地元のホビーショップやサイズ8縫針からモノフィラメント糸を使用して、従来のパラフィン組織包埋カセットの片側（StatLab猫＃H104、）に添付された。 </li><li>舌が固定化された後は、全体のカセットのアセンブリは、30ミリメートル組織培養皿に置かれ、1X PBSで浸漬した。 </li><li>処理された舌はすぐに2光子励起顕微鏡を使用した。 </li></ol> 6。二光子顕微鏡による舌腫瘍のイメージング<ol><li>舌のカセットは正立顕微鏡（;サターインスツルメンツ可動顕微鏡（MOM））の目的の下に配置引き込み式のカンチレバーアーム（商工会議所シャトル、シスキユー楽器）にカスタム設計されたホルダーに固定1X PBSを含む60ミリメートル皿に浸漬した。 </li><li> 40X/0.8NAの水浸対物レンズを直接目に見えるタム上または覆うように配置されたまたは病変。サファイアレーザー（ミラ、コヒーレント）60 MWを755 nmの入力波長での強度mCherry信号を最適化する：舌は、Tiとの二光子顕微鏡で画像化した。 </li><li>シリアル1ミリメートルのレーザースキャン画像は、15と100μm（腫瘍体積に応じて）の間の総組織の深さ以上1μmの増分の深さで採取された。画像はscanimage、カレルヴォ研究所（Janeliaファーム、HHMI）が開発したMATLABのプラットフォームをベースとしたオープンソースのプログラムを使用して捕獲された。 scanimageでもは、x / yガルバノスキャンミラーを制御するためにラスタスキャンパターンの2チャンネルの出力を生成し、同時に（PCI - 6610Sのデータ収集ボードを介して光電子増倍管（光電子増倍管）から同時に最大4チャンネルの信号の入力をキャプチャ、ナショナルインスツルメンツ）。 PMTの信号はモニター画面に表示するためにNI - DAQボードに供給する前に、低ノイズ電流のプリアンプ（SR570、スタンフォードリサーチシステム）により増幅される。 scanimageでも、客観的のz軸を制御することにより、Zスタック画像を収集し、単一またはサイクルモードでのタイムラプス画像を収集します。画像は16ビットの深さを持つ単一のTIFFファイルに保存されていました。 </li></ol> 7。アミラのソフトウェアを使用して、画像解析<ol><li>腫瘍定量のためのアミライメージング：Aimraのソフトウェアでは、Zスタック画像のセットを含むTIFFファイルを開きます。 </li><li>ファイル名を強調表示し、三次元レンダリングを生成するためにVoltex機能を選択して適用。総称して浸潤細胞のいくつかの小さな、解離侵襲グループ（IG）を持つ大規模な原発腫瘍の画像は、レンダリングされた画像（図6Aを参照）で典型的に明らかである。 </li><li>原発腫瘍の塊を選択し、次に"ラベルフィールド"、"ラベル"、"オープンデータ"を選択します。 </li><li>主な閾値すべてのZスタック画像を腫瘍には、選択して三次元の中で唯一の原発腫瘍塊を含めることを確保するためにz -平面の画像をスクロールします。これは通常、フィールドの最大サイズの画像であり、画像化されたが、z -平面を介して走査されたときに、多くの場合、セグメント化されます。 </li><li>腫瘍信号のいずれかをバックグラウンド蛍光を修正し、破棄することなく、画像からそれを排除するために魔法の杖/しきい値関数を使用してください。 "内部ファイル"のラベルをハイライトし、⊕のボタンをクリックします。 "すべてのスライス"のチェックボックスを選択します。これは、すべてのZスタックインクリメントの閾値原発腫瘍領域の周囲に色付きの境界線を生成します。 </li><li> IGSを選択するには、"新しい"機能を選択してください。単一のIGを選択して、z平面のスクロールでは、原発腫瘍に関連付けられていないことを確認してください。 </li><li> "すべてのスライス"を選択し、⊕のボタンをクリックします。ファイル（：IG 1 EX）の名前を変更</li><li> 7.4閾値処理手続きと決定IG 7.5のハイライト手順を繰り返します。原発腫瘍の塊を示すために使用される色とは異なる輪郭の色を選択します。 </li><li> IGSが示されているすべてを確実にするためにz -平面をスキャン、画像全体の各追加IGのため、必要に応じて手順を繰り返します。画像上で将来の識別で特定された各IGエイズのために異なる色を使用した。 </li><li>原発腫瘍と、すべてのIGSを選択したら、プルダウンメニューから"セグメンテーション"を選択し、"素材の統計"を選択します。これは、ボリュームの測定だけでなく、X、YとXの腫瘍の中心は、腫瘍の点から、IGSの距離を計算するために、原発腫瘍の座標を提供します。 </li><li>計算されたボリュームで、原発腫瘍の中央のコアから各IGの距離を決定する。その後、"セグメンテーション"、"マテリアルの統計"を選択してください。このステップでは、ピクセルにすべての測定値を計算します。顕微鏡対物と倍率の任意の追加増加（;ズーム機能すなわち）のキャリブレーションに基づいて、マイクロメートルにピクセルを変換します。顕微鏡およびこれらの実験で使用した設定については、40倍目標は1ピクセル= 0.298μmのキャリブレーションを与え、無ズームで使用されました。三次元での原発腫瘍（X1、Y1、Z1）と各IGのパラメータを与える（最初のIGのためのX2、Y2、Z2例）Excelスプレッドシートにデータをインポートします。 </li><li>原発腫瘍の中心から各IG用ミクロンの侵攻の距離は、式√を（（X2 - X1）2 +（Y2 - Y1）2 +（Z2 - Z1）2）を使用して計算されます。 </li><li>腫瘍浸潤性指数は、（T I）式T I = N T X V T ×奥行T、N、T =画像のIGSの合計数、V T =すべてのIGSの合計量、D Tを使用して計算されます=総走行距離は、原発腫瘍の中心部からすべての侵襲的なグループの旅。 </li></ol> 8。ニコンNIS - Elementsシリーズはソフトウェアと三次元のレンダリング<ol><li>より地形ディテールを持つ3つの次元のレンダリングは、ニコンNIS - Elementsシリーズはソフトウェアに腫瘍全体のイメージの元の16ビットのモノクロTIFFファイルをインポートして生成することができますパッケージ（ニコン、メルヴィル、ニューヨーク州）。その後、"ND"、"File"を選択し、次に"ファイルのシーケンスからNDファイルを作成します"。 TIFF Zシリーズの画像スタックを選択し、適切なステップサイズを指定します。 </li><li> xy平面上のNDの文書を校正します。マニュアルキャリブレーションを使用して1つのピクセルのサイズを指定します。 </li><li> "ボリュームの表示"を選択します。より高い品質に対してz平面上の追加のスライスを計算するために"HQ"機能を使用してください。 "3Dレンダラー設定"で、"超高詳細"と"フル解像度"の品質で"高度なレンダラ"を使用。腫瘍表面を強調する"アルファブレンディング"を選択します。 </li><li>プレゼンテーションのための三次元画像を最適化します。必要に応じて腫瘍と関連するIGSと作物上でズーム。のxyz平面内で画像を回転させるとLUTを調整する。 </li><li>プレゼンテーション用のイメージをキャプチャします。 "編集​​ - ビューの作成スナップショットを（8ビットRGB）"を選択します。それに応じてファイルに名前を付けて保存します。 </li></ol> 9。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="図1"> 図1。同所舌の腫瘍の生産とその場二光子イメージングの主要なステップを示す全体概略図。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="図2"> 図2マウスの舌にOSC19発現細胞LifeAct - mCherryの注入。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="図3"> 図3切除腫瘍を含むマウスの舌は、2光子イメージングのための準備。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="図4"> 図4。イメージングのための準備ができて二光子顕微鏡の位置で腫瘍を含む舌のオリエンテーション。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="図5"> 図5。scanimageでも、初期の二光子画像の生データの取得を証明するから撮影代表画面。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="図6"> 図6。同所OSC19の腫瘍の画像解析と腫瘍浸潤の定量化。アミラVoltexのレンダリング（）と単閾値のz -セクションの代表的なスクリーンショットの画像（B）青で概説紫、侵襲性グループ1（IG - 1）に記載されている主な原発腫瘍と、赤とIGに記載されているIG - 2 -3は、識別の手順の例として、緑色で概説。矢印がでIGSを表す（A）と（B）。ボリュームのC.プロットに対する腫瘍浸潤のインデックス（Ti）を計算するために使用される8個々のIGSの距離を侵略した。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="図7"> 図7。腫瘍の代表画像は、従来のIHCのアプローチからの画像と比較して、このプロトコルの腫瘍グループを侵略した。UMSCC1同所腫瘍を保有する全体のマウスの舌のA.パラフィンセクション。免疫組織化学的染色は、HNSCC特異的細胞マーカーEMMPRIN（Zymed社、猫＃34〜5600）に対する一次抗体で、従来の手順を用いて実施された1:1000希釈でとOmniMap DAB抗Rbの検出キット（Ventanaの猫＃760を使用して可視化-149）は鉄ヘマトキシリン​​染色が続く。総舌領域を包含する画像はオプトロニクスMicroFire CCDカメラでオリンパスZX70プロビス顕微鏡で4Xの倍率で個別に収集し、StereoINvestigatorイメージングパッケージを（MBFバイオサイエンス）を用いて再建された。腫瘍は舌の先端で明らかである。侵襲的なフロントおよび個々の腫瘍細胞群（矢印）を示す拡大地域は、代表的なOSC19の腫瘍の（B）。C.ニコンNIS - Elementsのレンダリングで表示されます。強化された輪郭の詳細とIGSの明確な可視化（矢印）が明らかである。すべての画像のバー= 100μmの。

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

同所性マウスモデルでは、頭頸部癌の1,2の多くの側面を研究するために有用であることが証明されている。私たちは、頭頸部腫瘍細胞の浸潤の初期の事象を研究するためのシステムとしてmCherry -標識細胞の二光子顕微鏡イメージングとSCOT 3の十分に確立された同所のシステムを組み合わせている。この手順では、我々は細胞が特に不足して舌の大きさのためにマウスの6週間若いに、腫瘍注射部位から漏れることができることに留意している。我々はこの問題を回避するためにそれ以上の年齢のマウスを使用してください。それ以上の年齢のマウスでより大きな舌の大きさにも舌から舌動脈と過度の出血の破裂を避けるためにも役立ちます。舌が飛躍的に最初の注射部位での膨潤時に腫瘍のテイクが大幅に強化されています。注入液が吸収されるので、これは一から二時間以内におさまるの腫れ。腫瘍の成長は、舌の表面に小さな白いバンプとして指示された注入さ細胞数で明らかに1〜2週間後に注射をされます。我々はまた、ここで紹介私たちの研究で使用されている40X目的で、我々は個々の腫瘍細胞を区別することはできませんが、HNSCC侵入の典型的なモードを再現侵襲的な細胞クラスターとしてIGSを識別することにも注意してください。 このモデルを今日まで広範囲に監視さ頸部リンパ節転移により測定された効果は、IHCまたは生物発光の方法4-7を使用して、SCOT成長上の特定の分子だけでなく、いくつかの抗腫瘍薬の役割侵入をテストするために使用されています。腫瘍は浸潤性多細胞クラスターとしてその場で画像全体の腫瘍への二光子顕微鏡の応用を可能にする、近い舌の表面（図7）にこのシステムのマニフェストに形成。手順は、携帯電話の解像度と腫瘍浸潤を可視化するために利用することができます。二光子顕微鏡は、以前は同所8,9および異種移植8,10モデルで頭頸部癌のための実験的な治療法を研究するために利用されている。しかし、これらの報告と我々のプロトコルには、2つの大きな違いがあります。最初に、これらの研究はおそらく循環への十分なアクセス権を持つ唯一の腫瘍細胞に検出を制限し、頭頸部腫瘍細胞を標的/識別するために、細胞外のラベルを使用してください。早期の転移活性は、実験パラメータとして評価されていない可能性が反復することに近いプライマリサイトへの腫瘍細胞の第二、侵略。我々のプロトコルは、直接マウスの舌に腫瘍の進行中の任意の時点で腫瘍細胞の浸潤を定量化する機能を提供します。ここで説明する方法は解剖舌を使って手順を説明しながら、我々は、同時に初期の浸潤、局所リンパ節転移との遠隔転移を監視するために生物発光との組み合わせで使用するための生きたマウスで画像の腫瘍の浸潤にこの方法を適応させるプロセスで、現在です。同じ動物。 in vivoイメージングのためのプロトコルへの変更は撮像中にマウスを配置し、維持するための適切な段階だけでなく、適切に画像処理手順の実行中に麻酔したマウスの口腔内を灌漑するための実用的なシステムの設計が必要です。一度に最適化された、これらの適応は、潜在的なプロ侵襲的分子とテスト抗浸潤局所浸潤に対する化合物および拡張期間にわたって動物のより多くの遠隔転移の関与の役割を研究する能力を提供します。

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

局所領域頭頸部癌の浸潤、転移のリスクにリンクされ、患者管理戦略の設計および実装の困難な課題を提示しています。口腔癌の同所性マウスモデルは、インパクトの侵略その要因の研究を促進し、抗腫瘍治療薬を評価するためのモデルシステムとして開発されている。これらのシステムでは、口腔組織内播種性腫瘍細胞の可視化では、通常、従来の組織型によってまたは in vivo生物発光の方法でと行われてきた。これらの技術の主な欠点は、正確に三次元でのプライマリサイトに起因する初期の腫瘍細胞の浸潤を可視化し定量化するための固有のできないことです。ここでは、舌腫瘍の広がりのマルチベクトル可視化を可能にするために二光子イメージングと舌の扁平上皮癌（SCOT）のための確立されたモデルを組み合わせたプロトコルについて説明します。 OSC - 19頭頸部腫瘍細胞株は安定的にmCherry蛍光タンパク質（LifeAct - mCherry）に融合した、F -アクチン結合ペプチドのLifeActを発現するように設計されました。これらの細胞を注入Fox1 nu / nuマウスでは、確実に舌が二光子顕微鏡の生体外のアプリケーションによって可視化するための腫瘍を形成。この手法は、腫瘍塊の同所性可視化を可能にし、局所的に地域の腫瘍の微小環境を中断することなく、切除された舌の細胞に侵入。さらに、このシステムは、原発腫瘍部位から細胞の移動を侵略した距離を計算することにより腫瘍細胞の浸潤の定量化が可能になります。全体的にこの手順では、SCOTの浸潤や局所浸潤や遠隔転移拡散を防止するために合わせた治療的処置に寄与する要因を分析するための拡張されたモデルのシステムを提供します。また、このメソッドは、最終的にin vivoでの設定での他の画像診断法と組み合わせることが可能性を秘めています。

標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。

頭頸部癌の局所・領域浸潤は転移リスクに関連しており、患者の治療計画の策定および実施において困難な課題となっています。

本手順の全体的な目的は、舌における腫瘍浸潤の可視化および定量化を可能にする口腔癌のマウスモデルを作製することです。まず、LifeAct-mCherryのレンチウイルス感染と安定クローンの選択により、二光子イメージング用の口腔扁平上皮癌細胞を樹立します。次に、麻酔をかけたヌードマウスの舌にLifeAct-mCherry標識細胞を注入し、同所異種移植腫瘍を作製します。次に、腫瘍を含む舌を二光子顕微鏡で撮像します。最終的に、新鮮な舌組織の二光子イメージングと、それに続く原発腫瘍および地域的に浸潤した細胞群のコンピュータ支援三次元再構成を通じて、舌筋内における局所的な口腔腫瘍浸潤を定量化した結果を得ることができます。免疫組織化学や生物発光イメージングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、腫瘍細胞の浸潤を三次元的に定量測定できる点にあります。この手法の意義は、腫瘍浸潤に関与するタンパク質の解析や、抗浸潤治療戦略における前臨床化合物の評価のためのモデルシステムを提供できることから、口腔癌の治療的介入へと広がります。一般的に、この手法に慣れていない人は、舌への腫瘍細胞の注入および2光子顕微鏡観察のための舌の準備が技術的に困難であり、習熟と練習を要するため、苦労することになります。腫瘍の注入と2光子観察のステップは習得が難しく、専門的なスキルを必要とするため、この手法を視覚的に確認することが極めて重要です。培養を開始します。10% FBS、1%ペニシリン・ストレプトマイシン、および1%非必須アミノ酸を添加したDMEMからなる完全培地で、ヒト頭頸部腫瘍細胞株を培養する。LIFE Act mCherryコーティング配列をpLL 7.0レンチウイルスベクターに導入するため、まず部位特異的変異導入を行い、親mCherry cDNAのSBF1認識部位に3つのサイレント変異を導入する必要がある。次に、両端にEcoRIおよびSBF1部位を持つ修飾Life Act mCherry配列をPCR増幅し、pLL 7.0にサブクローニングする。レンチウイルス発現システムに従い、pLL 7.0 LIFE Act mCherryコンストラクトを作製するため、パッケージング細胞株293Tを完全培地中でコンフルエンスが17〜40%になるまで培養する。CalFOSSを用いて、PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS 2およびP-VSVGベクターを、それぞれ3:2:1の比率で細胞にトランスフェクションします。24時間後、培地を新鮮な完全培地に交換し、その後72時間、12時間ごとに培地を回収・補充します。回収した培地を4°Cで保存し、LIFE Act M cherryを安定的に発現する頭頸部細胞株を作製します。回収した培地を4°Cで2000 RPM、10分間遠心分離し、ウイルスを含む清澄化した培地1 mLをOSC 19またはUS CCC 1細胞に添加して12時間培養します。細胞を洗浄し、さらに1 mLのウイルスを加えて12時間おきます。耐性コロニーを選択するため、200 mg/mLのピューロマイシンを含む培地で2週間培養します。生存したコロニーを視覚的にスクリーニングし、蛍光顕微鏡を用いてmCherryの発現を確認します。トリプシン処理を行い、滅菌済みの3 mmクローニングディスクを用いて個々の陽性コロニーを回収します。陽性細胞を、凍結保存するか、または正位腫瘍ゼノグラフト作製のための正位注入に使用するまで、200 mg/mL のピューロマイシンを含む培地で維持します。trypsin life Act. M cherry 発現腫瘍細胞を遠心分離し、約 2.5 × 10⁴ 個の細胞を 50 µL の完全培地に再懸濁します。腫瘍細胞を、27ゲージ 1/2インチ針を装着した 1 mL シリンジに充填します。次に、生後8週齢の雌のアチミックヌードマウスを、ケタミン 80 mg/kgとキシラジン 10 mg/kgの併用により麻酔します。動物の動きが止まったら、眼潤滑剤を塗布し、足底の爪を圧迫して反応がないことを確認します。マウスを37～40°Cのヒーティングパッド上で維持します。滅菌鉗子を用いて、舌先を優しく掴み、口腔外に引き出します。細胞を各舌の片側にゆっくりと注入し、舌の中央に球状の塊を作製します。マウスにyohi beingを2.1 mg/kg注入し、麻酔からの回復を監視するため、加熱パッドに戻します。マウスを、ソフトなトランスジェニック・ドウ・ダイエット（transgenic dough diet）を含む滅菌ケージに入れます。2〜3日ごとにマウスの体重を測定し、腫瘍の発生を視覚的に観察します。ex vivoイメージングに向けてマウスの舌を調製するため、異なるタイムポイントで腫瘍を保持しているマウスを安楽死させます。二酸化炭素吸入法を用いて舌を摘出し、1X PBSで洗浄します。その後、地域のホビーショップで購入したモノフィラメント縫製糸と8番の縫い針を使用します。舌を一般的なパラフィン組織包埋カセットの片側に固定します。舌が固定されたら、カセット全体を1x PBSに浸します。直ちに2光子顕微鏡を用いて舌の観察およびイメージングを行います。舌カセットを 1x PBS を含む 60 mm ディッシュに浸します。このディッシュを、2光子顕微鏡の対物レンズ下に配置された伸縮式カンチレバーアーム上のカスタム設計ホルダーに固定します。数値開口数 40 x 0.8 の水浸対物レンズを、視認できる腫瘍病変の直上または上に配置します。強さ60 milliwatts、入力波長755 nanometersのチタニウムサファイアレーザーを用いた二光子顕微鏡により、舌のイメージングを行います。M cherryシグナルを最適化するため、15から100 micrometersの全組織深さにわたり、1 micrometer刻みの深さで1 micrometer間隔のレーザースキャン画像を連続的に収集します。この構成により、組織深さ最大1 millimeterまでの腫瘍を解析することが可能です。画像のキャプチャには Scan image を使用します。Scan image は、XYガルバノメトリックスキャンミラーを制御するための2チャンネルのラスタースキャンパターン出力を生成すると同時に、データ収集ボードを介してフォトマルチプライヤーチューブからの最大4チャンネルの信号入力を同時にキャプチャします。Scan image は、対物レンズのZ軸を制御することでZスタック画像を収集し、シングルモードまたはサイクルモードでタイムラプス画像を収集します。画像を16ビット深度の単一のTIFファイルとして保存します。Amiraソフトウェアを使用して、Zスタック画像のセットを含むTIFファイルを開き、腫瘍画像のスタックを単一の3次元画像にレンダリングします。TEX関数を使用して、3次元レンダリングを生成してください。レンダリングされた画像には、いくつかの小さな解離性浸潤群（igs）を伴う、大きな原発腫瘍の画像が表示されると考えられます。腫瘍体積を測定するために、原発腫瘍領域の閾値を設定し、画像スタックの各スライスにおいて背景蛍光を補正および除去してください。浸潤群についても同様に閾値設定の手順を繰り返します。原発腫瘍およびすべての浸潤群（igs）を選択した後、原発腫瘍の体積測定値およびX、Y、Zの腫瘍OID座標を決定します。中心腫瘍点からigsまでの距離を算出するため、ti = NT × VT × dt という式を用いて、腫瘍浸潤指標（ti）を算出します。ここで、NTは画像内にあるigsの総数、VTはすべてのigsの総体積、DTは原発腫瘍の中心からすべての浸潤群が移動した総距離を表します。ソフトウェア内で元の16 bitモノクロチップファイルをNikon NIS-elementsにインポートすることで、より詳細な地形を持つ3次元レンダリングを生成できます。イメージスタックからNDファイルを作成してください。その後、ドキュメントを手動でキャリブレーションし、ピクセルサイズを指定することで、より高品質なレンダリングが可能になります。Z平面にさらにスライスを追加します。この図は、2光子イメージングのNIS-Elementsまたはミラーから取得した生データの例を示しています。ソフトウェアを使用して、この図に示す舌腫瘍の生データを再構成することができます。このパネルは、AmiraソフトウェアのTEX関数を使用した3次元レンダリングの例を示しています。ここでは、画像スタックから個々の2光子セクションを閾値処理し、原発腫瘍の中心（oid）および原発腫瘍から浸潤した集団を特定する例を示しています。各閾値処理セクションの解析後、Amiraは各浸潤集団の体積および中心（Centro）からの移動距離を定量化します。これらのデータはグラフで示すことができ、腫瘍細胞浸潤の完全なレベルの数値を得るために利用できます。ここに示されている原発部位に起因するものは、従来の病理学的免疫組織化学染色で可視化した腫瘍の代表的な画像であり、本プロトコルを用いて同様の腫瘍を3次元画像化したものと比較しています。舌の摘出から最終的な3Dレンダリングまでを習得すれば、適切に実施することでこの手法は約2時間で完了できます。この手順を行う際は、針で舌を貫通させて腫瘍細胞を失い、腫瘍の採取を妨げないよう注意してください。本手順に続いて、治療化合物やタンパク質レベルを操作した細胞の試験を行うことで、口腔癌の浸潤に対する有効性を判定できます。in vivoの環境において、レンチウイルスで改変したヒト腫瘍細胞を取り扱うことは危険であるため、適切な個人用保護具（PPE）の着用や、BSL-2認定の層流クリーンベンチ内での作業など、注入後のマウスを扱う際は常に十分な予防措置を講じてください。

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