口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

本手順の全体的な目的は、舌における腫瘍浸潤の可視化および定量化を可能にする口腔癌のマウスモデルを作製することです。まず、LifeAct-mCherryのレンチウイルス感染と安定クローンの選択により、二光子イメージング用の口腔扁平上皮癌細胞を樹立します。次に、麻酔をかけたヌードマウスの舌にLifeAct-mCherry標識細胞を注入し、同所異種移植腫瘍を作製します。

次に、腫瘍を含む舌を二光子顕微鏡で撮像します。最終的に、新鮮な舌組織の二光子イメージングと、それに続く原発腫瘍および地域的に浸潤した細胞群のコンピュータ支援三次元再構成を通じて、舌筋内における局所的な口腔腫瘍浸潤を定量化した結果を得ることができます。免疫組織化学や生物発光イメージングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、腫瘍細胞の浸潤を三次元的に定量測定できる点にあります。

この手法の意義は、腫瘍浸潤に関与するタンパク質の解析や、抗浸潤治療戦略における前臨床化合物の評価のためのモデルシステムを提供できることから、口腔癌の治療的介入へと広がります。一般的に、この手法に慣れていない人は、舌への腫瘍細胞の注入および2光子顕微鏡観察のための舌の準備が技術的に困難であり、習熟と練習を要するため、苦労することになります。腫瘍の注入と2光子観察のステップは習得が難しく、専門的なスキルを必要とするため、この手法を視覚的に確認することが極めて重要です。培養を開始します。

10% FBS、1%ペニシリン・ストレプトマイシン、および1%非必須アミノ酸を添加したDMEMからなる完全培地で、ヒト頭頸部腫瘍細胞株を培養する。LIFE Act mCherryコーティング配列をpLL 7.0レンチウイルスベクターに導入するため、まず部位特異的変異導入を行い、親mCherry cDNAのSBF1認識部位に3つのサイレント変異を導入する必要がある。次に、両端にEcoRIおよびSBF1部位を持つ修飾Life Act mCherry配列をPCR増幅し、pLL 7.0にサブクローニングする。レンチウイルス発現システムに従い、pLL 7.0 LIFE Act mCherryコンストラクトを作製するため、パッケージング細胞株293Tを完全培地中でコンフルエンスが17〜40%になるまで培養する。

CalFOSSを用いて、PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS 2およびP-VSVGベクターを、それぞれ3:2:1の比率で細胞にトランスフェクションします。24時間後、培地を新鮮な完全培地に交換し、その後72時間、12時間ごとに培地を回収・補充します。回収した培地を4°Cで保存し、LIFE Act M cherryを安定的に発現する頭頸部細胞株を作製します。回収した培地を4°Cで2000 RPM、10分間遠心分離し、ウイルスを含む清澄化した培地1 mLをOSC 19またはUS CCC 1細胞に添加して12時間培養します。

細胞を洗浄し、さらに1 mLのウイルスを加えて12時間おきます。耐性コロニーを選択するため、200 mg/mLのピューロマイシンを含む培地で2週間培養します。生存したコロニーを視覚的にスクリーニングし、蛍光顕微鏡を用いてmCherryの発現を確認します。トリプシン処理を行い、滅菌済みの3 mmクローニングディスクを用いて個々の陽性コロニーを回収します。

陽性細胞を、凍結保存するか、または正位腫瘍ゼノグラフト作製のための正位注入に使用するまで、200 mg/mL のピューロマイシンを含む培地で維持します。trypsin life Act. M cherry 発現腫瘍細胞を遠心分離し、約 2.5 × 10⁴ 個の細胞を 50 µL の完全培地に再懸濁します。腫瘍細胞を、27ゲージ 1/2インチ針を装着した 1 mL シリンジに充填します。

次に、生後8週齢の雌のアチミックヌードマウスを、ケタミン 80 mg/kgとキシラジン 10 mg/kgの併用により麻酔します。動物の動きが止まったら、眼潤滑剤を塗布し、足底の爪を圧迫して反応がないことを確認します。

マウスを37～40°Cのヒーティングパッド上で維持します。滅菌鉗子を用いて、舌先を優しく掴み、口腔外に引き出します。細胞を各舌の片側にゆっくりと注入し、舌の中央に球状の塊を作製します。

マウスにyohi beingを2.1 mg/kg注入し、麻酔からの回復を監視するため、加熱パッドに戻します。マウスを、ソフトなトランスジェニック・ドウ・ダイエット（transgenic dough diet）を含む滅菌ケージに入れます。2〜3日ごとにマウスの体重を測定し、腫瘍の発生を視覚的に観察します。

ex vivoイメージングに向けてマウスの舌を調製するため、異なるタイムポイントで腫瘍を保持しているマウスを安楽死させます。二酸化炭素吸入法を用いて舌を摘出し、1X PBSで洗浄します。その後、地域のホビーショップで購入したモノフィラメント縫製糸と8番の縫い針を使用します。

舌を一般的なパラフィン組織包埋カセットの片側に固定します。舌が固定されたら、カセット全体を1x PBSに浸します。直ちに2光子顕微鏡を用いて舌の観察およびイメージングを行います。

舌カセットを 1x PBS を含む 60 mm ディッシュに浸します。このディッシュを、2光子顕微鏡の対物レンズ下に配置された伸縮式カンチレバーアーム上のカスタム設計ホルダーに固定します。数値開口数 40 x 0.8 の水浸対物レンズを、視認できる腫瘍病変の直上または上に配置します。

強さ60 milliwatts、入力波長755 nanometersのチタニウムサファイアレーザーを用いた二光子顕微鏡により、舌のイメージングを行います。M cherryシグナルを最適化するため、15から100 micrometersの全組織深さにわたり、1 micrometer刻みの深さで1 micrometer間隔のレーザースキャン画像を連続的に収集します。この構成により、組織深さ最大1 millimeterまでの腫瘍を解析することが可能です。

画像のキャプチャには Scan image を使用します。Scan image は、XYガルバノメトリックスキャンミラーを制御するための2チャンネルのラスタースキャンパターン出力を生成すると同時に、データ収集ボードを介してフォトマルチプライヤーチューブからの最大4チャンネルの信号入力を同時にキャプチャします。Scan image は、対物レンズのZ軸を制御することでZスタック画像を収集し、シングルモードまたはサイクルモードでタイムラプス画像を収集します。

画像を16ビット深度の単一のTIFファイルとして保存します。Amiraソフトウェアを使用して、Zスタック画像のセットを含むTIFファイルを開き、腫瘍画像のスタックを単一の3次元画像にレンダリングします。TEX関数を使用して、3次元レンダリングを生成してください。

レンダリングされた画像には、いくつかの小さな解離性浸潤群（igs）を伴う、大きな原発腫瘍の画像が表示されると考えられます。腫瘍体積を測定するために、原発腫瘍領域の閾値を設定し、画像スタックの各スライスにおいて背景蛍光を補正および除去してください。浸潤群についても同様に閾値設定の手順を繰り返します。

原発腫瘍およびすべての浸潤群（igs）を選択した後、原発腫瘍の体積測定値およびX、Y、Zの腫瘍OID座標を決定します。中心腫瘍点からigsまでの距離を算出するため、ti = NT × VT × dt という式を用いて、腫瘍浸潤指標（ti）を算出します。ここで、NTは画像内にあるigsの総数、VTはすべてのigsの総体積、DTは原発腫瘍の中心からすべての浸潤群が移動した総距離を表します。

ソフトウェア内で元の16 bitモノクロチップファイルをNikon NIS-elementsにインポートすることで、より詳細な地形を持つ3次元レンダリングを生成できます。イメージスタックからNDファイルを作成してください。その後、ドキュメントを手動でキャリブレーションし、ピクセルサイズを指定することで、より高品質なレンダリングが可能になります。

Z平面にさらにスライスを追加します。この図は、2光子イメージングのNIS-Elementsまたはミラーから取得した生データの例を示しています。ソフトウェアを使用して、この図に示す舌腫瘍の生データを再構成することができます。

このパネルは、AmiraソフトウェアのTEX関数を使用した3次元レンダリングの例を示しています。ここでは、画像スタックから個々の2光子セクションを閾値処理し、原発腫瘍の中心（oid）および原発腫瘍から浸潤した集団を特定する例を示しています。各閾値処理セクションの解析後、Amiraは各浸潤集団の体積および中心（Centro）からの移動距離を定量化します。

これらのデータはグラフで示すことができ、腫瘍細胞浸潤の完全なレベルの数値を得るために利用できます。ここに示されている原発部位に起因するものは、従来の病理学的免疫組織化学染色で可視化した腫瘍の代表的な画像であり、本プロトコルを用いて同様の腫瘍を3次元画像化したものと比較しています。舌の摘出から最終的な3Dレンダリングまでを習得すれば、適切に実施することでこの手法は約2時間で完了できます。この手順を行う際は、針で舌を貫通させて腫瘍細胞を失い、腫瘍の採取を妨げないよう注意してください。本手順に続いて、治療化合物やタンパク質レベルを操作した細胞の試験を行うことで、口腔癌の浸潤に対する有効性を判定できます。

in vivoの環境において、レンチウイルスで改変したヒト腫瘍細胞を取り扱うことは危険であるため、適切な個人用保護具（PPE）の着用や、BSL-2認定の層流クリーンベンチ内での作業など、注入後のマウスを扱う際は常に十分な予防措置を講じてください。