siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

以下の実験の全体的な目的は、ニトロセルロース膜を用いて、HIV-1 gp120タンパク質に対するRNA Aptimaをin vitroで生成することです。これはPCRと、それに続くin vitro T7転写によって達成されます。第2ステップとして、初期DNAおよびランダムRNAライブラリを調製し、標的タンパク質とRNAライブラリの混合物を事前に湿らせたニトロセルロースフィルターに適用することで、結合したRNA分子を未結合のRNA種から分離します。

12回の選別サイクル後、ライブラリから個々のRNAアプタマー候補を特定するために、RNAライブラリのクローニングとシーケンシングを行います。ゲルシフトアッセイおよび共焦点顕微鏡観察に基づき、ナノモル濃度の親和性を持つ複数の新しいアプタマーを特定する結果が得られました。ビーズやカラムを用いた分離法などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は簡便であることであり、タンパク質をビーズに固定化するなど、タンパク質やライブラリの前処理を必要としません。抗HIV GP120 RNAアプタマー分離用のRNAライブラリは、50ヌクレオチドのランダム配列を含む市販の合成DNAライブラリから調製します。

一本鎖DNAオリゴライブラリの配列は81ヌクレオチドの長さです。この図に示すように、ランダム領域は、5'末端の30の腫瘍領域と3'末端の16 MAという定常領域によって挟まれています。定常領域には、in vitro転写用のT7プロモーターと、RT-PCR用の3'タグが含まれています。

元のDNAライブラリの組成（アバンダンス）を維持するため、PCRサイクル数を10サイクルに制限し、一本鎖DNAオリゴランダムライブラリを増幅させます。PCR反応後、増幅された二本鎖DNAプールをゲル精製キットを用いて回収します。次に、製造者の指示に従いcriptキットを用いて二本鎖DNAをRNAライブラリに変換します。なお、転写反応液中のCTPおよびUTPを、リボヌクレアーゼ耐性RNAを生成するために2-フルオロピリミジンCTPおよび2-フルオロピリミジンUTPに置き換えてください。

転写反応が完了したら、DS1で反応液を消化してテンプレートDNAを除去し、8%ポリアクリルアミド・7M尿素ゲルを用いて精製します。最後に、UV分光光度計を用いて精製したRNAライブラリーを定量します。オプティマーの選別を行う前に、必要なバッファーを調製し、適切な温度で保存してください。

室温で保存したHeapsバッファーと、-20 °Cで保存したRNAリフォールディング用およびRNA結合用バッファーを用意します。選択の第1サイクルを開始する前に、フィルターへの非特異的結合を最小限に抑えるため、ランダムRNAプールを室温で30分間、あらかじめ濡らしたニトロセルロースフィルターに前処理します。30分後、ニトロセルロースフィルターを取り除きます。

プレクリア済みのランダムRNAプールとHIV-1 gp120タンパク質を低塩RNA結合バッファー中で混合し、回転台上にて室温で30分間インキュベートします。次に、反応液をあらかじめ濡らしたニトロセルロースフィルターに通し、1 mLの低塩RNA結合バッファーで洗浄して、フィルターから結合したRNAを溶出させます。フィルターホルダーからニトロセルロース膜を取り除きます。

メンブレンに200 µLの溶出バッファーを加え、95 °Cで5分間加熱します。RNAがフィルターから溶出された後、チューブを短時間遠心分離し、RNA溶液を新しいチューブに移して、その抽出液にフェノール・クロロフォーム抽出を行います。MicroCon YM 30カラムを使用してRNAを濃縮し、回収したRNAを20 µLのRNaseフリー水で溶出します。

回収したRNAプールを逆転写し、PCRで15サイクル増幅させます。増幅された二本鎖プールを精製した後、前述の方法に従って新しいRNAプールに転写し、次の選択ラウンドに備えます。RNAプールを1倍のHBSバッファー中で再折り畳みし、95 °Cで3分間加熱した後、37 °Cまでゆっくりと冷却します。

37 °Cで10分間、インキュベーションを継続します。リフォールディングしたRNAを吸着させ、次回のセレクションラウンドで標的となるHIV gp120タンパク質とインキュベートする前に、ニトロセルロースフィルターで30分間プルダウンします。より高い結合親和性を持つアプタマーを効率的に得られるよう、セレクション条件を調整してセレクションの厳格さを慎重に制御する必要があります。

選別条件をこの表に示します。Cellexのラウンド1から4では、あらかじめプレクリアしたRNAプールを、低塩濃度のRNA結合バッファー中で標的タンパク質と共に30分間インキュベートします。Cellexの第4ラウンド終了後は、以降のCellexプロセスに高塩濃度のRNA結合バッファーを使用してください。

各サイクルのアプタマー選択における厳密性を高めるため、gp120タンパク質の量を減らし、競合相手となる酵母tRNAを増やします。HIV-1 gp120アプタマー選択の進行状況は、フィルター結合アッセイによってモニタリングされます。このビデオでは、すべての選択サイクル後に回収された12個のRNAプールをアッセイします。

まず、各RNAプールを、37 °Cで1時間、ウシ腸管ホスファターゼで処理し、開始点の5'末端三リン酸を除去します。T4ポリヌクレオチドキナーゼと³²Pによるラベル化に向けてCIP処理済みRNAを調製するため、95 °Cで5分間加熱した後、氷上で冷却します。RNAのラベル化は、放射性物質を扱うためのホットルーム内で、PNKバッファー、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、γ-³²P-ATP 1 µL、および滅菌水を加え、合計20 µLとして行います。37 °Cで30分間インキュベートします。

30分後、各反応液に20 µLの水を加え、G 50カラムで精製します。最終的に、最終濃度250 nMでリフォールドしたラベル化RNAを40 µL回収し、各ラベル化RNAプールを1× HBSバッファー中で95 °Cで3分間加熱します。その後、37 °Cまで冷却します。これには30～40分かかります。

37 °Cでさらに10分間インキュベートします。RNAプールのリフォールディングが完了したら、100 µLの結合反応を行います。末端標識したRNAプール、GP one 20タンパク質、および10倍モル過剰の非特異的競合TRNAを、高塩濃度RNA結合バッファー中で混合し、室温で30分間インキュベートします。

30分後、あらかじめ濡らしておいたニトロセルロースフィルターを用いて、結合反応液から 50 µL を分取します。次に、フィルターを 2 mL の結合バッファーで洗浄し、汎用シンチレーションカウンターを用いてフィルターに保持された放射能を測定し、入力コントロールカウントとします。同時に、結合反応液の残りの 50 µL を用いて、各選択サイクルの後のRNAプールの結合アッセイを、競合TRNAを用いたフィルター結合アッセイにより解析し、HIV-1 GP120 の進捗をモニタリングしました。

Optimaの選択結合活性は、ここに示したように、タンパク質-RNA複合体としてフィルター上に保持された投入RNAの割合（%）として算出した。開始RNAプールでは、メンブレンに保持された投入RNAはわずか0.1%であった。しかし、9回の選択ラウンド後、9回目のRNAライブラリでは投入RNAの9.72%が結合していた。

追加の選択ラウンドを実施したものの、それ以上の濃縮は見られず、RNAプールの最大結合量に達したことが示唆された。RNAプールの結合活性は、ゲルシフトアッセイによってさらに確認した。これらの結果は、標的タンパク質に対して高い結合特異性を持ついくつかのリガンドが、これらのRNAプールにおいて連続的に濃縮されたことを示している。

この例では、12回目のセレクションラウンド後にRNAプールの最大結合量に達したため、12回目のRNAプールが最高の結合活性を示しました。このRNAプールを逆転写してcDNAとし、その後PCRで増幅させました。次にPCR産物を精製してTAクローニングベクターに組み込み、140個のクローンのアライメント後に配列決定を行いました。その結果、anti GP one 20 optimasの6つのグループが同定されました。

この表には、Aptimaコア領域のランダム配列のみが示されています。クローンの約40%に保存配列が含まれていました。ネイティブゲル移動度シフトアッセイによる各グループ内での相対的な存在量に基づき、各グループから1つの代表的な配列をさらなる特性解析のために選択しました。これらの代表的なアプタマーの解離定数KDが算出されました（例：A1）。

最適化された抗体の中で最良のものは、52 nanomolarの見かけのKD値を持ちます。ここに示されている通りです。これらの選別された抗体は、標的であるHIV-1 gp120には選択的に結合しますが、HIV-1 gp120 CMタンパク質には結合しません。HIVエンベロープ糖タンパク質gp160を安定発現するCHO G160細胞を用いて、選別された抗gp120オプティマーの結合能および細胞内取り込み能を試験しました。

これらの細胞は、エンベロープのプロセシングに必要なgagコード化プロテアーゼを欠いているため、GP160をGP120およびgp41に処理しません。フローサイトメトリー分析により、S3標識アプタマーはCHO GP160細胞には特異的に結合しますが、GP160を発現していないコントロールのCHO EE細胞には結合しないことが明らかになりました。さらに、リアルタイム生細胞Zスタック共焦点顕微鏡観察により、2時間のインキュベーション後、S3標識アプタマーはCHO GP160細胞に選択的に取り込まれますが、CHO EEコントロール細胞には取り込まれないことが示されました。また、アプタマーが細胞質内で凝集していることが観察され、GP120アプタマーは受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞内に進入する可能性が示唆されました。

最後に、このビデオを視聴することで、フィールドベースの測定法を用いてRNA Aberを単離する方法とその活用について、十分に理解できたはずです。