Name: siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学ぶ HIV-1 gp120ターゲットのRNAアプタマーin vitro選択法。ニトロセルロースフィルターSELEXを用いて高親和性アプタマーを単離し、アプタマー-siRNAキメラによる細胞特異的siRNA導入と抗HIV治療への応用を探索する。

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我々は、有用な議論をブリッタヘーン、桂花日、ハリスSoiferとリサシェーラーに感謝。 CHO - EEとCHO - gp160細胞：この作品は、NIHのエイズ研究とレファレンス試薬プログラム、エイズの部、NIAID、NIHによって得られた健康AI29329と、以下の試薬をJJRに授与HL07470の国立研究所からの補助金によって支えられてライン、pNL4 - 3リュックベクトル、HIV - 1 DAIDSからBALのgp120、NIAID。

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<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. RとJZは、&quot;HIV - 1治療のための細胞型に特異的なアプタマー - siRNAのデリバリーシステム&quot;で特許申請中を持っている。 USPTOは、No<strong&gt; 12/328994</strong&gt;、発行日：2009年6月11日。

アプタマーは、in vitroで標的分子に8〜タイト結合、それによって高度に特異的な提供、具体的かつ安定的な三次元形状を想定して核酸を進化させています。低ナノモル結合親和性とそのターゲットへのアプタマーの絶妙な特異性がin vivoイメージング、および治療​​9 で 、それらの診断のための多目的なツールとして利用できます。標的siRNA導入のためのアプタマー技術の出現によりそれが今のsiRNA 10-12受容体介在性エンドサイトーシスのためのアプタマー結合機能を使用することは可能です。膜受容体に対して惹起アプタマーは、治療効果を高めるだけでなく、薬の望ましくない毒性副作用を減少させることができる細胞型特異的に13で明確な疾患や組織を標的とする有望な送達ビヒクルとして浮上している。 これまでのところ、悪性細胞の特定の細胞型またはサブポピュレーションが正常に蛋白質ベースのSELEXまたは無傷の細胞ベースのSELEXプロセスのいずれかの伝統的な精製...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> MF -ミリポアメンブレンフィルタ</td><td>ミリポア</td><td> HAWP01300 </td><td>孔径0.45μmの</td></tr><tr><td> Swinnexフィルターホルダー</td><td>ミリポア</td><td> SX0001300 </td><td> 13mmの直径</td></tr><tr><td> QIAquickゲル抽出キット</td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> DNAの精製</td></tr><tr><td>マイクロコンYM - 30カラム</td><td>ミリポア</td><td> 42410 </td><td> RNAの濃度</td></tr><tr><td>バイオスピン30カラム</td><td> Bio - Rad社</td><td> 732-6250 </td><td> RNA精製</td></tr><tr><td> TaqのPCRのDNAポリメラーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT - PCRシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> T7転写キットをDuraScribe </td><td>シャーロット</td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> PCR用のdNTP </td><td>ロッシュ</td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td>リボ核酸、大腸菌からの転送</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R1753 </td><td> tRNAの競合</td></tr><tr><td> HIV - 1 Baの- Lのgp120タンパク質</td><td>エイズの研究およびリファレンス試薬プログラム</td><td> 4961 </td><td>標的タンパク質</td></tr><tr><td>サイレンサーsiRNAの標識キット - Cy3標識</td><td>アンビオン</td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td>酸5月1日クロロホルム/フェノール溶液（pH 4.5） </td><td>アンビオン</td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム/イソプロパノール1分の24のソリューション</td><td>シグマ</td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ腸ホスファターゼ（CIP） </td><td>ニューイングランドBioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>ニューイングランドBioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>ロッシュ</td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA沈殿</td></tr><tr><td> γ- 32 P - ATP </td><td> MPバイオメディカル</td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40パーセントAccuGel夜07時01分</td><td>ナショナル診断</td><td> EC - 850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td>ナショナル診断</td><td> EC - 860 </td><td></td></tr><tr><td> N、N、N、N&#39; -テトラメチルエチレンジアミン（TMEMD） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム（APS） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L - methioineスルホキシ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M5379 - 250ミリグラム</td><td></td></tr><tr><td> RPMIメディア1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム溶液、7.5％w / vの</td><td>インビトロジェン</td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地（MEM）（10） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸（100） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td>をpCR 2.1とTAクローニングキット</td><td>インビトロジェン</td><td> K2040 - 01 </td><td></td></tr></tbody></table>

sirna導入のための細胞型に特異的な抗hiv gp120のアプタマーの開発

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

HIVによる感染の世界的流行は、抗レトロウイルス薬の新しいクラスのための緊急の必要性を作成しています。相補的RNA転写産物の発現を阻害する低分子干渉（SI）RNAの強力な能力は、HIVを含む疾患の様々な治療薬の新しいクラスとして悪用されています。多くのこれまでの報告では、新たなRNAiベースanti-HIV/AIDS治療戦略は、かなりの期待を持っていることが示されているが、成功した治療への応用およびsiRNAの臨床翻訳の鍵の障害は、効率的な配信です。特に、RNAiベースの治療薬の安全性と有効性を検討し、それは特定の細胞集団または組織に標的細胞内のsiRNA導入のアプローチを開発することが極めて望ましい。 HIV - 1のgp120タンパク質、HIV - 1の表面上の糖タンパク質のエンベロープは、CD4細胞へのウイルスの侵入に重要な役割を果たしている。 HIV - 1のエントリをトリガし、細胞融合を開始することをgp120とCD4の相互作用は、薬物発見のための臨床的に関連する抗ウイルス戦略として検証されています。 ここで、我々はまず、2&#39; - F改変抗HIV gp120のRNAアプタマーの選択と識別を議論する。従来のニトロセルロースフィルターSELEX法を用いて、ナノモル親和性を持ついくつかの新しいアプタマーは、50のランダムなNT RNAライブラリーから単離された。が正常に高い親和性で結合した種を得るためには、選択のストリンジェンシーは、慎重に条件を調整することによって制御される。選択されたアプタマーは、特異的に結合することができ、急速にHIV - 1エンベロープタンパク質を発現する細胞に取り込まれる。さらに、単独でアプタマーはHIV - 1感染を中和することができる。最高のアプタマー- 1に基づき、我々はまた、アプタマーやsiRNAの両方の部分が強力な抗HIV活性を持つ新規な二重の阻害機能抗gp120のアプタマー - siRNAのキメラを作成してください。さらに、我々はHIV - 1感染細胞へのsiRNAの細胞型特異的送達のためのgp120アプタマー - siRNAのキメラを利用する。キメラこの二重の機能は、抑制するHIV - 1感染の様々な核酸治療薬を（アプタマーとsiRNA）を組み合わせた高活性抗レトロウイルス療法（HAART）を失敗した患者のためのアプタマー - siRNAのキメラの魅力的な治療候補者を作るための大きな可能性を示しています。

ナノモル親和性HIV - 1BA - Lのgp120に対するいくつかの2&#39; -フルオロRNAアプタマーは、RNAのライブラリーからで隔離されています<em&gt; in vitroで</em&gt; SELEX手順。新しいデュアル阻害機能抗gp120のアプタマー - siRNAのキメラが作成され、全身の抗HIV治療のためにかなりの期待を示しています。

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

HIV感染の世界的な流行により、新しいクラスの抗レトロウイルス薬に対する急務が生じています。小型干渉...

以下の実験の全体的な目的は、ニトロセルロース膜を用いて、HIV-1 gp120タンパク質に対するRNA Aptimaをin vitroで生成することです。これはPCRと、それに続くin vitro T7転写によって達成されます。第2ステップとして、初期DNAおよびランダムRNAライブラリを調製し、標的タンパク質とRNAライブラリの混合物を事前に湿らせたニトロセルロースフィルターに適用することで、結合したRNA分子を未結合のRNA種から分離します。12回の選別サイクル後、ライブラリから個々のRNAアプタマー候補を特定するために、RNAライブラリのクローニングとシーケンシングを行います。ゲルシフトアッセイおよび共焦点顕微鏡観察に基づき、ナノモル濃度の親和性を持つ複数の新しいアプタマーを特定する結果が得られました。ビーズやカラムを用いた分離法などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は簡便であることであり、タンパク質をビーズに固定化するなど、タンパク質やライブラリの前処理を必要としません。抗HIV GP120 RNAアプタマー分離用のRNAライブラリは、50ヌクレオチドのランダム配列を含む市販の合成DNAライブラリから調製します。一本鎖DNAオリゴライブラリの配列は81ヌクレオチドの長さです。この図に示すように、ランダム領域は、5'末端の30の腫瘍領域と3'末端の16 MAという定常領域によって挟まれています。定常領域には、in vitro転写用のT7プロモーターと、RT-PCR用の3'タグが含まれています。元のDNAライブラリの組成（アバンダンス）を維持するため、PCRサイクル数を10サイクルに制限し、一本鎖DNAオリゴランダムライブラリを増幅させます。PCR反応後、増幅された二本鎖DNAプールをゲル精製キットを用いて回収します。次に、製造者の指示に従いcriptキットを用いて二本鎖DNAをRNAライブラリに変換します。なお、転写反応液中のCTPおよびUTPを、リボヌクレアーゼ耐性RNAを生成するために2-フルオロピリミジンCTPおよび2-フルオロピリミジンUTPに置き換えてください。転写反応が完了したら、DS1で反応液を消化してテンプレートDNAを除去し、8%ポリアクリルアミド・7M尿素ゲルを用いて精製します。最後に、UV分光光度計を用いて精製したRNAライブラリーを定量します。オプティマーの選別を行う前に、必要なバッファーを調製し、適切な温度で保存してください。室温で保存したHeapsバッファーと、-20 °Cで保存したRNAリフォールディング用およびRNA結合用バッファーを用意します。選択の第1サイクルを開始する前に、フィルターへの非特異的結合を最小限に抑えるため、ランダムRNAプールを室温で30分間、あらかじめ濡らしたニトロセルロースフィルターに前処理します。30分後、ニトロセルロースフィルターを取り除きます。プレクリア済みのランダムRNAプールとHIV-1 gp120タンパク質を低塩RNA結合バッファー中で混合し、回転台上にて室温で30分間インキュベートします。次に、反応液をあらかじめ濡らしたニトロセルロースフィルターに通し、1 mLの低塩RNA結合バッファーで洗浄して、フィルターから結合したRNAを溶出させます。フィルターホルダーからニトロセルロース膜を取り除きます。メンブレンに200 µLの溶出バッファーを加え、95 °Cで5分間加熱します。RNAがフィルターから溶出された後、チューブを短時間遠心分離し、RNA溶液を新しいチューブに移して、その抽出液にフェノール・クロロフォーム抽出を行います。MicroCon YM 30カラムを使用してRNAを濃縮し、回収したRNAを20 µLのRNaseフリー水で溶出します。回収したRNAプールを逆転写し、PCRで15サイクル増幅させます。増幅された二本鎖プールを精製した後、前述の方法に従って新しいRNAプールに転写し、次の選択ラウンドに備えます。RNAプールを1倍のHBSバッファー中で再折り畳みし、95 °Cで3分間加熱した後、37 °Cまでゆっくりと冷却します。37 °Cで10分間、インキュベーションを継続します。リフォールディングしたRNAを吸着させ、次回のセレクションラウンドで標的となるHIV gp120タンパク質とインキュベートする前に、ニトロセルロースフィルターで30分間プルダウンします。より高い結合親和性を持つアプタマーを効率的に得られるよう、セレクション条件を調整してセレクションの厳格さを慎重に制御する必要があります。選別条件をこの表に示します。Cellexのラウンド1から4では、あらかじめプレクリアしたRNAプールを、低塩濃度のRNA結合バッファー中で標的タンパク質と共に30分間インキュベートします。Cellexの第4ラウンド終了後は、以降のCellexプロセスに高塩濃度のRNA結合バッファーを使用してください。各サイクルのアプタマー選択における厳密性を高めるため、gp120タンパク質の量を減らし、競合相手となる酵母tRNAを増やします。HIV-1 gp120アプタマー選択の進行状況は、フィルター結合アッセイによってモニタリングされます。このビデオでは、すべての選択サイクル後に回収された12個のRNAプールをアッセイします。まず、各RNAプールを、37 °Cで1時間、ウシ腸管ホスファターゼで処理し、開始点の5'末端三リン酸を除去します。T4ポリヌクレオチドキナーゼと³²Pによるラベル化に向けてCIP処理済みRNAを調製するため、95 °Cで5分間加熱した後、氷上で冷却します。RNAのラベル化は、放射性物質を扱うためのホットルーム内で、PNKバッファー、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、γ-³²P-ATP 1 µL、および滅菌水を加え、合計20 µLとして行います。37 °Cで30分間インキュベートします。30分後、各反応液に20 µLの水を加え、G 50カラムで精製します。最終的に、最終濃度250 nMでリフォールドしたラベル化RNAを40 µL回収し、各ラベル化RNAプールを1× HBSバッファー中で95 °Cで3分間加熱します。その後、37 °Cまで冷却します。これには30～40分かかります。37 °Cでさらに10分間インキュベートします。RNAプールのリフォールディングが完了したら、100 µLの結合反応を行います。末端標識したRNAプール、GP one 20タンパク質、および10倍モル過剰の非特異的競合TRNAを、高塩濃度RNA結合バッファー中で混合し、室温で30分間インキュベートします。30分後、あらかじめ濡らしておいたニトロセルロースフィルターを用いて、結合反応液から 50 µL を分取します。次に、フィルターを 2 mL の結合バッファーで洗浄し、汎用シンチレーションカウンターを用いてフィルターに保持された放射能を測定し、入力コントロールカウントとします。同時に、結合反応液の残りの 50 µL を用いて、各選択サイクルの後のRNAプールの結合アッセイを、競合TRNAを用いたフィルター結合アッセイにより解析し、HIV-1 GP120 の進捗をモニタリングしました。Optimaの選択結合活性は、ここに示したように、タンパク質-RNA複合体としてフィルター上に保持された投入RNAの割合（%）として算出した。開始RNAプールでは、メンブレンに保持された投入RNAはわずか0.1%であった。しかし、9回の選択ラウンド後、9回目のRNAライブラリでは投入RNAの9.72%が結合していた。追加の選択ラウンドを実施したものの、それ以上の濃縮は見られず、RNAプールの最大結合量に達したことが示唆された。RNAプールの結合活性は、ゲルシフトアッセイによってさらに確認した。これらの結果は、標的タンパク質に対して高い結合特異性を持ついくつかのリガンドが、これらのRNAプールにおいて連続的に濃縮されたことを示している。この例では、12回目のセレクションラウンド後にRNAプールの最大結合量に達したため、12回目のRNAプールが最高の結合活性を示しました。このRNAプールを逆転写してcDNAとし、その後PCRで増幅させました。次にPCR産物を精製してTAクローニングベクターに組み込み、140個のクローンのアライメント後に配列決定を行いました。その結果、anti GP one 20 optimasの6つのグループが同定されました。この表には、Aptimaコア領域のランダム配列のみが示されています。クローンの約40%に保存配列が含まれていました。ネイティブゲル移動度シフトアッセイによる各グループ内での相対的な存在量に基づき、各グループから1つの代表的な配列をさらなる特性解析のために選択しました。これらの代表的なアプタマーの解離定数KDが算出されました（例：A1）。最適化された抗体の中で最良のものは、52 nanomolarの見かけのKD値を持ちます。ここに示されている通りです。これらの選別された抗体は、標的であるHIV-1 gp120には選択的に結合しますが、HIV-1 gp120 CMタンパク質には結合しません。HIVエンベロープ糖タンパク質gp160を安定発現するCHO G160細胞を用いて、選別された抗gp120オプティマーの結合能および細胞内取り込み能を試験しました。これらの細胞は、エンベロープのプロセシングに必要なgagコード化プロテアーゼを欠いているため、GP160をGP120およびgp41に処理しません。フローサイトメトリー分析により、S3標識アプタマーはCHO GP160細胞には特異的に結合しますが、GP160を発現していないコントロールのCHO EE細胞には結合しないことが明らかになりました。さらに、リアルタイム生細胞Zスタック共焦点顕微鏡観察により、2時間のインキュベーション後、S3標識アプタマーはCHO GP160細胞に選択的に取り込まれますが、CHO EEコントロール細胞には取り込まれないことが示されました。また、アプタマーが細胞質内で凝集していることが観察され、GP120アプタマーは受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞内に進入する可能性が示唆されました。最後に、このビデオを視聴することで、フィールドベースの測定法を用いてRNA Aberを単離する方法とその活用について、十分に理解できたはずです。

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

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siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

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