使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

この手順の全体的な目標は、ニューロン胚性中枢神経系における遺伝子発現を変化させることです。これは、最初に時限妊娠女性を入手し、手術の準備をすることによって達成されます。次に、腹部切開を生成することにより、子宮角が露出します。

胚が露出すると、DNAは側脳室、第3脳室、または網膜下腔に注入されます。手順の最後のステップは、子宮壁を介して胚に電流を流し、正極がトランスフェクションの好ましい部位に配置されるようにパドル電極を向けることです。最終的には、免疫蛍光顕微鏡法を通じて、tline kelon死にゆくケロンおよび網膜における神経前駆細胞の増殖、移動、および分化を示す結果を得ることができます。

この技術や既存の方法(トランスジェニックマウスの変性など)の主な利点は、迅速で、より高いスループットの研究を可能にし、低コストであることです。この方法は、どの遺伝子が神経前駆細胞、細胞増殖、細胞運命の仕様、ニューロンの分化、細胞移動を調節するかなど、神経発生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味するところは、中枢神経系の発達における欠陥を強調した遺伝的経路のより良い理解に向けて拡張される可能性があり、その多くは認知障害をもたらし、ヒトにおける行動障害である中枢神経系の発達を理解する上でのその有用性を超えて。

この技術は、発達中の末梢神経系、心臓、胎盤などの他の臓器系にも適用できます。また、マウスだけでなく、chickやxipなどの他のモデル生物の疾患モデルの研究にも適用できます。一般的に、この技術に不慣れな個人の成功への主な障害は、胚を操作し、注入し、穴を開ける際には、胚の生存に注意を払う必要があります。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、胚、終脳、網膜の遺伝子発現を迅速に操作する手段が必要だったときでした。この技術は、2001年にDevelopmental Biology誌に掲載されたSalが最初に記述した技術を修正して、私たちの研究室で開発されました。また、クラッシュラボと協力して、開発中のディロンでもこのプロトコルを確立しました。

注入とエレクトロポレーションのステップは、胚の非常に慎重な操作が必要であり、注入部位が非常に小さい場合があるため、習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。例、網膜下空間 今日の手順を示すのは、シャーマン研究所のポスドクであるラジブです すべての手術器具の洗浄と滅菌を開始します。次に、シリンジに生理食塩水と授乳リンガー溶液を入れ、それらを加熱パッドの上に置いて手術領域を温めます。

70%エタノールで加熱パッドを滅菌し、次に滅菌したリンプレスガーゼパッドで覆います。加熱パッドを摂氏37度に設定します。動物を小さな麻酔室に入れ、気化器を介して1分あたり1リットルで5%イソフッ素と酸素を送達することによって麻酔をかけます。

アイソフッ素排気は必ず掃気装置で回収してください。動物の呼吸が深く規則的になったら、チャンバーから取り出します。つま先をつまむ反射とまばたき反射を使用します。

完全な麻酔を確保するため。麻酔をかけた動物を腹に置き、手術中に人工呼吸器チューブを使用して2.25%のフッ素を送達します。首筋に体重1キログラムあたり0.1ミリグラムの濃度でブプレノルフィンを皮下

動物の呼吸を引き続き監視し、必要に応じてイソフッ素の流れを調整します。次に、麻酔をかけた動物の胸部にテープを貼り、鈍い鉗子で後足をつまんで収縮反応を再度確認します。滅菌綿棒を使用して、腹部に厚いデクリームの層を広げ、アンダーファーが完全にコーティングされていることを確認します。

クリームを約3分間そのままにし、断続的に脱毛を確認します。滅菌綿棒を使用して、滅菌ガーゼパッドを滅菌水で濡らし、腹部から髪を拭き取ります。次に、切開部位をクロルヘキシジンとさらに水で滅菌します。

腹部を清潔な滅菌ガーゼで乾かします。新鮮な滅菌綿ガーゼを使用して、70%エタノールでこの手順を繰り返します。手術用の服を着て子宮角を露出させて手術の準備

まず、線状のアルバを正中線の皮膚の下のかすかな線として見つけます鉗子を使用して、皮膚を腹壁から引き離し、湾曲した鉗子とハサミを使用した皮膚はさみで中腹部から下に小さな直線切開を切ります。腹膜でこのプロセスを繰り返します。鉗子で腹膜をつかみます。

引き離してから、子宮を引き抜くのに十分な大きさの切開部をカットします。切開部に小さな垂直スリットが入った滅菌ガーゼを置き、温かい滅菌生理食塩水で湿らせます。次に、鉗子を切開部にスライドさせ、鉗子で切開部を開いたままにしている子宮を見つけます。

1番目と2番目の目に見える胚の間の子宮をつかみ、子宮角の両側をガーゼに引っ張ります。吸収や体のサイズが小さい胚に注目する胚の数を数えます。正しい数のDNA注射を準備するために、子宮角を生理食塩水で濡らし、1つの子宮角を慎重に腹部に戻します。

手術針を嫌うには、マウスピースが取り付けられたプルアップパストピペットを使用して、1ミリリットルあたり3ミリグラムの10マイクロリットルを吸い上げます。エンドトキシンフリーのDNA溶液にメチルグリーン色素を配合し、DNAを手術針に排出します。最初に充填された針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。

卵巣に最も近い胚から始めて、インジェクターに取り付けます。円形鉗子を使用して、胚を脱落膜内で静かに回転させ、胚が正面を向くようにして、ROSロールで臍帯方向に注射できるようにします。光ファイバー光源を使用して、胚の脳の正中線を特定します。

吻側領域に隣接する大きな側脳室に注意してください。湾曲した鉗子を使用して胚を所定の位置に保持し、脳への侵入角度が約45度になるように、充填された外科用針を子宮の上に配置します。マイクロマニピュレーターのダイヤルを素早く安定した動きで回し、針先を子宮壁から胎児の脳の側脳室に挿入します。

次に、マイクロインジェクターのフットパッドを押します。DNA溶液を注入するためには、メチルグリーン色素を胚性脳室全体に広げることにより、成功した注入を容易に視覚化することができます。DNAが注入されたので、針をゆっくりと引き戻して、破損を引き起こさずに針を取り除きます。

注入した胚を滅菌ガーゼに置き、温かい生理食塩水で十分に濡らします。パドル電極の正極をトランスフェクションの所望の部位の上に置いて子宮をつかみます。次に、40〜50ボルトと50ミリ秒の5つの正方形の電気パルスを、1秒あたり1パルスの速度で送達します。

注入され、電気定格の胚を保護用の湿ったガーゼで覆い、次に次の胚を注入し続けます。子宮角内のすべての望ましい胚の注入とエレクトロペリングが完了したら、慎重に体腔に押し戻します。2番目の子宮角を取り外して、残りの胚の注射とエレクトロポレーションを開始します。

すべての胚が子宮内に戻ったら、腹腔に2〜3ミリリットルの温かい生理食塩水を追加し、次に腹部からガーゼを取り外して腹膜の側面を露出させます。黒い編みこみのシルクラインを使用して、胸骨に最も近い腹膜にラインを固定し、アンカーから離れてステッチを進めることにより、腹膜を縫合します。すべての縫合糸がしっかりと締まっていること、および下にある臓器や皮膚が腹膜に縫い付けられていないことを確認してください。

残りの縫合線をクリップして廃棄します。皮膚閉鎖ステープルを使用して、鉗子で縫合線上で皮膚を閉じます。縫合線を下にステープルで留めたり、皮膚を強く引っ張ったりしないように注意して、皮膚をクリップします。

終了したら、縫合ツールと一緒に静かに押してステープルがしっかりと締まっていることを確認します ここで、GFPの発現を駆動するA-P-C-I-G 2つの発現ベクトルがE12で発達中の新皮質にエレクトロポレーションされています。新皮質の発達が進むと、頂端前駆細胞は二次基底前駆細胞または有糸分裂後ニューロンのいずれかに分化し、GFPを発現し続けます。次に、これらの神経細胞を解析して、赤色で示された神経サブタイプの典型的なマーカーの発現を調べることができます。

E 12でエレクトロポレーションされ、E 14で解剖された胚の前脳のこの静脈図では、エレクトロポレーション部位はE 14による緑色の蛍光光によって示されます。GFPの発現は、視床前、視床前、視床下部に見られ、死にかけているlic領域が成功裏にトランスフェクションされたことを示しています。ダッシュボックスは、1つの心室ゾーンを通るセクションの位置を示します。

心室ゾーンを詳しく見ると、GFP細胞が心室ゾーンからマントルゾーンに移動することがわかります。視床下部核が形成される場所では、胚性網膜も、この冠状切片に示すように、E 16.5 Iを介して容易にエレクトロポレーションされます。E 15.5でPCICでエレクトロポレーションします。ここで、mチェリー陽性細胞の蓄積は、外側の神経芽細胞層に特異的であり、神経節細胞層内のB rrnの3つのB陽性網膜神経節細胞では見られない

この手順を試みるときは、適切な滅菌技術を使用し、胚を操作するときは安定した手を使用し、妊娠中の女性を麻酔下に置く前に必要なすべての材料を準備しておくことが重要です。この手順に続いて、電気編組胚を成人期まで生きさせることができ、その時点で、胚の特定の遺伝子の操作が成人のニューロン機能にどのように影響するかに関する追加の質問に答えるために、行動アッセイや機能アッセイなどの他の方法を実行できます。この技術は、その開発以来、CNS開発分野の研究者がマウスの生体内で遺伝子機能を探求する道を開いてきました。

このビデオを見れば、胚の神経管に外来DNAを導入する方法についてよく理解できるはずです。具体的には、妊娠中の女性に手術の準備をする方法をお見せします。子宮を露出させ、DNAを注入し、胚を電解質化します。

イソフフッ素の取り扱いは危険な場合があるため、この手順を実行する際には清掃システムなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。