Name: 使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: 学ぶ子宮内電気穿孔法による胎児CNSへの遺伝子導入技術。大脳、間脳、網膜など複数の領域に標的DNAを送達し、神経前駆細胞の増殖と分化を解析する効率的なプロトコルです。

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著者らは、CS研究室で子宮内エレクトロポレーション技術の確立に彼らの初期の仕事のためにエヴァHadzimova、ピエールMattarとクリストファーコバックに感謝します。この作品は、カナダ保健研究所（CIHR）助成金（MOP 44094）とDMKにCSとアルバータ州の小児病院研究財団助成するチームグラント（00933から000を）新興CIHR /財団ファイティング失明（FFB）によって賄われていた。 RDがCIHRカナダホープ奨学金によってサポートされていた、RCは、FFBの学生の身分によってサポートされており、LMLは、遺伝学のCIHRトレーニンググラントと子どもの発達によってサポートされていました。

<ol><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li>
<li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li>
<li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries%3A+implications+for+neuronal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

子宮内エレクトロポレーションは、発生過程の様々な分析に使用することができます。例えば、このようなGFP、mCherryまたはアルカリホスファターゼなどのレポーター遺伝子のトランスフェクションは、系統のトレースとニューロン移動の実験を行うために使用することができます。また、Creリコンビナーゼは、一時的に選択的に空間的および/または時間的に制御された方法でfloxed対立遺伝子を排除するために表現することができます。さらに、shRNAまたはドミナントネガティブ構築物は、ノックダウンの標的遺伝子の機能に電気穿孔することができます。最後に、野生型および/または遺伝的変異マウスラインの両方で重要な遺伝子の標的過剰発現またはmisexpressionは、細胞の運命決定を研究するために使用することができます。それは非常に短い時間の要因の多くの組み合わせのテストを可能にするため、このアッセイのハイスループットは非常に重要です。注意いずれかのノートでは、この手順では、細胞内の遺伝子発現に変化をもたらすを行うことであり、その針の侵入部位（すなわち、傷口にアップレギュレート傷害応答遺伝子;として私達と他の13で観測...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>カテゴリ</th></tr><tr><td>ファインはさみ</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 14078〜10 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>湾曲したアイリスはさみ、 </td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 14061〜10 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>オルセン-ヘーガル元繊細なニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 12002〜12 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>リング鉗子、9mmの</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 11103〜09 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>アイドレッシングForcep </td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 11051〜10 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>デュモン＃7 DMX Forcep </td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 11271〜30 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>デュモン＃5 DMX Forcep </td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 11251〜30 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>組織forcep -アドソン</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 11027〜12 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>反射のクリップア</td><td>世界の精密機器</td><td> 500343 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>穴あきスプーン、直径15mm </td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td> 10370〜18 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td> Autoclipリムーバー</td><td>ミクロン</td><td> 427637 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>シルクブラック編組縫合糸</td><td>エチコン社</td><td> K871 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td>反射スキンクロージャーステンレス鋼創傷クリップ</td><td>世界の精密機器</td><td> 500346 </td><td> 外科ツール </td></tr><tr><td> ECM 830方形波のエレクトロポレーションシステム</td><td> VWR - CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>ピンセットのw /可変ギャップ2ラウンド、5mm、プラチナプレート電極</td><td>プロテックインターナショナル（株） </td><td> CUY650P5 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>ピンセットのw /可変ギャップ2ラウンド7ミリメートルプラチナプレート電極</td><td>プロテックインターナショナル（株） </td><td> CUY650P7 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>エッペンドルフFemtojetマイクロインジェクター</td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111 - 488 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>エッペンドルフFemtojetマイクロインジェクター用フットコントロール</td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS（MISC.） </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td> Bransonic超音波洗浄機モデル1510R - DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995 - 534 CPN - 952〜118 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>サターP97マイクロピペットプラー</td><td>サターインストゥルメント、Carsenグループ本社</td><td> P - 97 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>マイクロピペット - フィラメント径を持つホウケイさ：1mm、ID：0.78ミリメートル、10 cmの長さ</td><td>サターのインストゥルメント</td><td> BF100 - 78から10 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td> 3軸粗動マニピュレーター</td><td>カールツァイスカナダ株式会社</td><td> M - 152 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータのための磁気保持装置</td><td>世界の精密機器</td><td> M1 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータ用スチールベースプレート</td><td>世界の精密機器</td><td> 5052 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダー</td><td>世界Prのecisionインスツルメンツ</td><td> MPH3 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>マイクロピペットハンドル</td><td>世界の精密機器</td><td> 5444 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> MZ6 </td><td> 楽器 </td></tr><tr><td>イソフルラン麻酔用気化器</td><td>ポーターインストルメンツカンパニー</td><td> MODEL 100 - F </td><td>楽器</td></tr><tr><td>手術器具を超音波処理するためのMetriclean2低起泡性ソリューション</td><td> Metrexリサーチ株式会社</td><td> 10から8100 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td>縫合後、0.2グラムのメチレンブルー抗生物質噴霧のゲンタマイシン40mg/ml </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G1264 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td>手術器具を滅菌するためのGermex </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN＃00141569 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td> BNPの眼軟膏</td><td> Vétoquinol </td><td> DIN＃00516414 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td>ナイル® </td><td>教会＆ドワイト株式会社によって配布</td><td>市販</td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4パーセントw / vの皮膚洗浄剤</td><td>オメガラボラトリーズ株式会社</td><td> 01938983 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td>ブプレノルフィン（Temgesic）鎮痛剤</td><td>シェリングプラウ</td><td> 531から535 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td> Sulpha&quot;25&quot;sulphamethazine経口抗生物質</td><td>専門の獣医研究所</td><td> DIN＃00308218 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td>乳酸リンゲル液</td><td>バクスター株式会社</td><td> DIN＃0061085 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td>生理食塩水 - 0.9％の塩化ナトリウム</td><td> B -ブラウンメディカル株式会社</td><td> DIN＃01924303 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td>吸入麻酔 - イソフルランUSP </td><td>カナダ社の製薬パートナー</td><td> DIN＃02237518 </td><td> 外科的試薬 </td></tr><tr><td>ファストグリーンFCF </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F7252 </td><td> 外科的試薬 </td></tr></tbody></table>

使用した複数のcns準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

遺伝子発現を操作する機能は、複数の発達経路の解明につながる、現代の実験発生学の基礎となるものです。いくつかの強力で定評のトランスジェニック技術の喪失と機能獲得型モデルの両方の生成を可能にする、マウスの遺伝子発現レベルを操作するために用意されています。しかし、マウス遺伝子組換えの世代は、コストと時間がかかるものです。遺伝子操作の代替の方法では、広く求められている。 子宮内エレクトロポレーションで、我々は正常に3,4を適応しているライブのマウス胚の1,2への遺伝子送達の方法です。それは、主に一般的にニワトリ5で使用されているOVOエレクトロポレーション技術での成功に基づいています。簡単に言えば、DNAは細胞へのDNAの取り込みを可能にする、脳の発達と電流の原因は細胞膜に一時的な細孔の形成のアプリケーションのオープン脳室に注入されます。若い胚のターゲティングは、超音波ガイド下マイクロインジェクションのプロトコル、前述の6に説明を必要としながら私たちの手では、胚を効率的に、胎生（E）11.5早くも電気穿孔することができます。逆に、E15.5は、脳へのマイクロインジェクションを妨げる頭頂と前頭骨分化の開始、のために我々が簡単にエレクトロできる最新の舞台です。対照的に、網膜は胚発生の終わりを介してアクセス可能です。胚は、胚や初期の産後の全期間を通して、いつの時点で収集することができます。レポーターコンストラクトの注入は、トランスフェクトされた細胞の同定を容易にする。 日付に、子宮内エレクトロポレーションで最も広く新皮質の発達1,2,3,4の分析に使用されています。最近の研究では、胚性網膜7,8,9と視床10,11,12を標的にしている。ここで、我々は簡単胚中枢神経系の別のドメインをターゲットに適応させることができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルに変更を提示。我々は、このテクニックを使用することによって、我々は胚の終脳、間脳や網膜をターゲットにできるという証拠を提供する。代表的な結果は、私たちは胚の終脳の前駆細胞の成熟、分化と移行を監視することが、最初の側脳室へのDNAの発現コンストラクトを導入するためにこのテクニックの使用を示す、表示されます。我々はまた、この技術は間脳核に神経細胞を分化回遊経路をモニタすることで、第3脳室周囲の間脳の領域にDNAをターゲットとするために使用することができることを示している。最後に、我々は、マイクロマニピュレータの使用は私たちが網膜の開発に遺伝子発現を操作するの効果を分析できるように、網膜下腔を含め、私たちは正確に小さなターゲットの領域にDNA構築物を導入することができることを示している。

子宮内エレクトロポレーションでは発達中の中枢神経系（CNS）における空間的および時間的に制御された方法で迅速な遺伝子デリバリーを可能にする。ここでは、終脳、間脳や網膜など、複数の胚中枢神経系領域、中に発現構築物を提供するために使用することができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルにおける適応性の高いを説明します。

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

遺伝子発現を操作する能力は現代の実験発生学の根幹であり、数多くの発生過程の解明につながっています。

本手順の全体的な目的は、胚性中枢神経系のニューロンにおける遺伝子発現を改変することです。まず、タイミングを合わせた妊娠雌個体を入手し、手術の準備を行います。その後、腹部切開を行い、子宮角を露出させます。胚を露出させた後、DNAを側脳室、第三脳室、または網膜下腔に注入します。手順の最終ステップとして、子宮壁を通じて胚に電流を流します。この際、パドル電極を調整し、陽極が目的のトランスフェクション部位の上に位置するように配置します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、tline kelon dying kelonおよび網膜における神経前駆細胞の増殖、遊走、および分化を示す結果を得ることができます。この手法の、トランスジェニックマウスの作製などの既存の方法に対する主な利点は、迅速であり、よりハイスループットな研究が可能で、コストを低く抑えられることです。この方法は、どの遺伝子が神経前駆細胞、細胞増殖、細胞運命決定、ニューロン分化、および細胞遊走を制御しているかといった、神経発達分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の意義は、中枢神経系（CNS）の発達不全の根底にある遺伝的経路のより深い理解へと広がる可能性があり、その多くはヒトにおける認知機能障害や行動障害を引き起こします。これは、中枢神経系の発達を理解する上での有用性にとどまらず、さらなる応用が期待されます。この手法は、発達中の末梢神経系、心臓、胎盤などの他の器官系にも適用できます。また、マウスの疾患モデルだけでなく、ニワトリやゼブラフィッシュ（xip）などの他のモデル生物を用いた研究にも適用可能です。一般的に、この手法を初めて行う方にとって最大の課題は胚の生存率であり、胚の操作、注射、および注ぎ込みの際には細心の注意を払う必要があります。私たちは、胚、終脳および網膜において遺伝子発現を操作するための迅速な手段を必要とした際に、まずこの手法を考案しました。私たちは、2001年にDevelopmental Biology誌で発表されたSalによる当初の手法を改変し、自らの研究室でこの技術を開発しました。また、共同研究室と協力し、発生過程にあるdilonにおいてもこのプロトコルを確立させました。注入およびエレクトロポレーションの工程は、胚の非常に慎重な操作が必要であり、注入部位が極めて小さい場合があるため、習得が困難です。そのため、本手法の視覚的な実演が不可欠となります。例えば、網膜下腔などが挙げられます。本日は、Sherman研究室のポストドクであるRajivが手順を実演します。まず、すべての手術器具を洗浄し、滅菌します。次に、シリンジに生理食塩水および乳酸リンガー液を満たし、手術エリア内のヒータパッドの上に置いて加温します。ヒーティングパッドを70% ethanolで滅菌し、滅菌済みの Lint-fr

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発展途上のマウス脳への遺伝子導入法は、ユニークな手術法と電極の特殊な形状を用いて記述されます。このユニークな手法は、脳の発達の研究に多くの神経科学者を支援する時間的および空間的にプラスミドDNAのトランスフェクションすることができます。...

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体性幹細胞の増殖を制御することは、彼らの研​​究と治療における使用を妨げる大きな要因となっている。ここでは、一時的にマウス脳で生成されたニューロンの数を増やすために使用することができます開発と成人期における神経幹細胞の膨張を制御するためのシステムを説明します。...

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

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新生児軟膜表面エレクトロ

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