Name: 蛍光in situハイブリダイゼーションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡による口蓋パンダの口腔バイオフィルムの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶ 蛍光in situハイブリダイゼーションと共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた口蓋パンダの口腔バイオフィルム解析法。細菌コミュニティの構造と組成を可視化し、歯周病研究への応用可能性を示します。

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この作品は、医科大学グラーツの衛生フォンによってサポートされていました。すべての被験者は、彼らのインフォームドコンセントを与えた。治験実施計画書の制度的承認は、医科大学グラーツから入手したものです。

1。検体収集<ol><li>口腔内のサービスの4ヶ月後に固定口蓋パンダを取り外します。 （図1および図2）、それらを削除する前にアプライアンスを分離するためにNOLAドライフィールドのシステムを使用してください。 </li><li>汚染（図3と図4）を追加することなく、パンダを除去する滅菌ペンチ、手袋、トレーを使用してください。 </li><li> -20℃でザルスタット120ミリリットル瓶で保管してオブジェクト24時間以内に氷やプロセス上の実験室に連れて行く。 </li></ol> 2。バイオフィルムの固定<ol><li>滅菌メスでバイオフィルムフレークを削り取る、または滅菌ピンセットで作品を収集​​。 </li><li>サンプルが十分に覆われるまで氷冷4％PFA溶液を加える。 </li><li> 3〜12時間のために4 ° C（凍結しない）で混合物をインキュベートする。長い固定時間以上固定温度は、オリゴヌクレオチドプローブへの透過性が低いグラム陰性細胞の細胞エンベロープをレンダリングしてもよい。 </li><li> PFA溶液を除去し、氷冷した1 × PBSで洗浄する。 rにこの手順を2〜3回繰り返す残留PFAを残したまま削除する。 </li><li> 1巻のサンプルを再懸濁します。氷冷した1 × PBSと1容量を加える。氷冷96％（v / v）エタノール。 </li><li> -20℃でサンプルを保存するこのプロトコルに従って固定サンプルは、年に数ヶ月間保存することができます。 </li></ol> 3。固定試料の脱水<ol><li>顕微鏡スライドにPFA固定試料物質5〜30μlを適用します。 </li><li> 46で乾燥℃で約15分間以上室温で。リゾチームとホルムアミドを解凍。 </li><li>したがって、細胞壁の部分的な破壊によって細胞内へのプローブの浸透を促進する、10分間室温でリゾチーム（1mg/ml）250μlを添加する。 </li><li> 50％、3分ごとに80％、96％（v / v）エタノールに浸漬スライド。エタノールの濃度系列の脱水効果は、細胞膜を崩壊されます。 </li><li> ℃で10分間、46でスライドを乾燥させる。 </li></ol> （4） のin - situハイブリダイゼーション<ol><li> 1 mlの準備新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液（濃度は表1を参照）。本研究で使用したホルムアミド濃度：10％（EUBmix）、20％（Bac303、POGI、MUT590）または45％（LGCmix）。 </li><li>オリゴヌクレオチドプローブ溶液を融解。解凍したプローブは氷上で保存し、光から保護する必要があります。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液200μlに各プローブ2μl加え、よく混ぜ、顕微鏡スライド上に脱水試料に混合物を適用する。 </li><li>正方形のペトリ皿にティッシュを一枚の紙を置き、ティッシュペーパーの上に残っているハイブリダイゼーション緩衝液を注ぐ。 </li><li>すぐに皿に水平にスライドを置き、皿を閉じます。 46℃で1〜5時間（90分、ほとんどのケースで十分です）のためにオーブンでインキュベートする。スライドからハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防止する水分室など、料理機能。特に、ホルムアミドの蒸発は、非標的細胞への非特異的プローブを引き起こす可能性があります。 </li><li> （conceは表2を参照の洗浄バッファー50 mlを調製ntrations）。 48に50 mlチューブおよび予熱の洗浄バッファーを準備℃の水浴中。洗浄工程は48℃で行われ</li><li>ハイブリダイゼーションオーブンからスライドして皿を取り外します。すぐに予め温めておいた洗浄液は少量でハイブリダイゼーション緩衝液を洗い流し、そして残りの洗浄バッファにスライドを移す。 </li><li> 10〜15分間48℃で水浴し、インキュベートに戻し、洗浄バッファとスライドを含むチューブを置きます。 </li><li>チューブからスライドを削除し、残留洗浄バッファーを除去するために2〜3秒間氷冷のddH 2 Oに手をつける。 </li><li> （圧縮空気の使用を推奨）可能な限り迅速にスライドを風乾する。速乾性は、プローブ解離が削減されます。 </li><li>乾燥スライドはプローブ与え蛍光シグナルをあまり失うことなく、数週間のために-20℃で暗所に保存することができます。 </li></ol> 5。顕微鏡検査<ol><li> FISHと洗浄後に、APPLスライドの左右の端（凍結切片を前にこのステップに室温に温める必要があります）にantifadent近いのy 2滴。 </li><li>上に顕微鏡のカバーガラスを置き、antifadentはスライド全体に広がるまで待ちます。 antifadent量が過剰となり、顕微鏡の画像をぼかすことができることに注意してください。 </li><li>適切なフィルターまたはレーザーを搭載した共焦点レーザー走査型顕微鏡で試料を観察。私たちは、ライカTCSユニット（; NA 1.2 HCX PL APO/63x）を使用。データは、IMARISやアミラなどのソフトウェアで解析することができます。 </li><li>プローブ与え蛍光が減少し始める前にantifadentに埋め込まれているスライドは、° C（​​凍結しない）までの7日間まで4で保存することができます。また、antifadentはのddH 2 Oを用いて削除することができます、そして乾燥させたスライドは、長時間にわたって-20℃で保存することができます。 </li></ol> 6。代表的な結果： （固定矯正装置からバイオフィルムを掻き図5）顕微鏡用コーティングガラススライド上に直接ハイブリダイズすることができる適切なフレーク（図6）が得られます。このように、orobiome細菌の異なるグループに異なる名前が付けられ、特定のプローブ（図7及び図8）とタギング細菌のリボソームRNAによって彼らの自然な三次元環境で識別することができます。図7においては、バイオフィルムはEUBmix（緑、すべての細菌）とLGCmix（黄色、Firmicutes）で染色した。彼らは、黄色とブルーで染色したとしてFirmicutesは、​​緑色で表示されます。図8では、バイオフィルムはEUBmix（赤、すべての細菌）、Bac303（青、Bacteroidetes）とPOGI（黄色、 ポルフィロ歯周 ）で染色した。すべての3つのプローブは、そのDNAと重複するバインドとしてポルフィロ歯周が 、黄白色で表示されます白信号での色の結果。細菌のグループとの間の形態的な違いは、（図9と図10）を同定することができます。球状​​の細菌の大規模なクラスタは、染色がEUBmix（緑、すべてのBAで実施された図9に示されていますcteria）。口腔内細菌の異なる形状は球状と糸状菌がEUBmix（赤）で染色することによって区別す​​ることができます図10に可視化した。また、バイオフィルムの典型的なキノコ状の構造がCLSMのデータの3Dモデリング（図11および12）を介して処理することができると、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">3Dモデリングの映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1は、。 場で口蓋エキスパンダーを修正しました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。Nolaのドライフィールドシステム。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3は、。ペンチ、手袋とトレイを滅菌。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4削除パンダ。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。滅菌メスでバイオフィルムを掻き。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。樹脂フレークに直接コーティングされたガラススライド上にハイブリダイズさせた。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7 CLSM像：特定の細菌群の分化。 3D CLSMのスタックデータの2Dオーバーレイ。バイオフィルムはEUBmix（緑、すべての細菌）とLGCmix（黄色、Firmicutes）で染色。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図8"> 図8 CLSM像：特定の細菌群の分化。 3D CLSMのスタックデータの2Dオーバーレイ。 EUBmix（赤、すべての細菌）、Bac303（青、Bacteroiで染色したバイオフィルムdetes）とPOGI（黄色、 ポルフィロ歯周 ）。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図9"> 図9 CLSM像：特定の形態の分化。 3D CLSMのスタックデータの2Dオーバーレイ。バイオフィルムはEUBmix（緑、すべての細菌）で染色。球状​​の細菌の大規模なクラスタ（矢印）。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図10"> 図10 CLSM画像：特定の形態の分化。 3D CLSMのスタックデータの2Dオーバーレイ。バイオフィルムはEUBmix（赤、すべての細菌）で染色。球状​​（下矢印）と糸状菌（上記の矢印）を区別することができます。 <img alt="図11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図11"> 図11。キノコの構造、下から3Dビュー。 EUBmixと手順で染色したバイオフィルムフレークのスタック（矯正装置の表面掻き）、IMARIS（CLSM像）とssed。 <img alt="図11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図11"> 図12。キノコの構造、3D側面図。 IMARIS（CLSM像）で処理したバイオフィルムフレークのスタック（矯正装置の表面掻き）。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> ハイブリダイゼーション緩衝液（200μl） </td></tr><tr><td> ホルムアミド濃度 </td><td> 10パーセント </td><td> 20パーセント </td><td> 45パーセント </td></tr><tr><td> 5 M NaClを </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 Mトリス塩酸 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2％SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> 任意のFISHプローブ </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> 表1。ハイブリダイゼーションバッファーの成分（μlの濃度）。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 洗浄バッファー（50 ml）を </td></tr><tr><td> ホルムアミド濃度 </td><td> 10パーセント </td><td> 20パーセント </td><td> 45パーセント </td></tr><tr><td> 5 M NaClを </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 Mトリス塩酸 </td><td> 1000年</td><td> 1000年</td><td> 1000年</td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> のddH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> 表2。洗浄バッファーの成分（μlの濃度）。 映画は1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。</a>

<ol><li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li>
<li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+among+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Communication among oral bacteria.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).</li>
<li>Zijnge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilm+architecture+on+natural+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oral biofilm architecture on natural teeth.</a> PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluorescent+in+situ+hybridization+for+the+specific+detection+and+quantification+of+oral+streptococci+in+dental+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque.</a> J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).</li>
<li>Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+in+dental+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions in dental biofilm development.</a> J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).</li>
<li>Jung, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+initial+bacterial+colonization+on+dentine+and+enamel+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ.</a> J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).</li>
<li>Al-Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+enamel+in+situ+investigated+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization.</a> J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).</li>
<li>Bryers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Medical biofilms.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).</li>
<li>Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+the+bacterial+community+associated+with+the+reindeer+lichen+Cladonia+arbuscula+reveals+predominance+of+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+biofilm+formation+and+the+effects+of+antimicrobial+agents+on+orthodontic+bonding+materials+in+a+parallel+plate+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Orthod%22%5BJournal%5D)">Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber.</a> Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).</li>
<li>Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes%3A+new+features+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007.</a> Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).</li>
<li>Diaz, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).</li>
<li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+and+successions+during+plaque+development%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions and successions during plaque development.</a> Periodontology. 42, 47-79 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+multispecies+biofilm+development+and+the+key+role+of+cell-cell+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).</li>
<li>Chalmers, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+monitoring+the+development+of+bacterial+biofilms+in+human+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets.</a> FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).</li>
<li>Moter, A., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.</a> J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここに記述されたプロトコルは、硬い材料から採取した染色のバイオフィルムへの高加工性アプローチです。サンプリングとハイブリダイゼーションは、最も重要なステップです。サンプリング時には、注意は十分な厚さのスライスがバイオフィルムの構造が損なわれないということを確実に収集されることを注意する必要があります。ハイブリダイゼーションの間に、それはこのように蛍光標識プローブの非特異的結合、または結合の損失を、避け、温度の過度の変動を避けるために不可欠です。このFISHプロトコルは、その組成を中断することなく、直接スライドガラス上に正常異種のバイオフィルムを染色するエレガントな方法です。スライドはすぐに再度サンプルを移動することなく、顕微鏡に使用することができます。このように、チューブ内の染色以上の改善がバイオフィルムに適用される以下のせん断力によって達成されます。 &gt;50μm厚のスライスは、この方法で調製し、調べることができます。

蛍光in situハイブリダイゼーションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡による口蓋パンダの口腔バイオフィルムの解析

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

自然の異種バイオフィルムの共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）は本日、そのうちの一つは、in situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光であること、染色技術の包括的な範囲によって促進される。1,2は、我々は、口腔バイオフィルムのサンプルは、固定から収集したパイロットスタディを実施矯正装置（口蓋パンダは）自然なバイオフィルムとプラークの蓄積の三次元組織を評価するという目的、FISHによって染色した。3,4 FISHが蛍光標識16Sを使用することにより、ネイティブのバイオフィルム環境で細胞を染色するための機会を作成するrRNAを標的とするプローブを。4-7,19は、免疫蛍光ラベルのような代替技術と比較すると、これは、混合バイオフィルムのコンソーシアムに異なる細菌のグループを調査するために安価な、正確でわかりやすい標識法である。18,20一般的なプローブが使用されていたその真正細菌に結合する（ EUB338 + EUB338II + EUB338III、以下EUBmix）、80〜10 Firmicutes（LGC354 AC;以下LGCmix）、9,10およびBacteroidetes（Bac303）さらに11、 ストレプトコッカスミュータンス （MUT590）12,13と病菌歯周への結合を特異的プローブ（POGI）13,14が使用された。関与する表面物質の極端な硬さは（ステンレスとアクリル樹脂）フィルムを準備する新しい方法を見つけるために私たちを強要。これらの表面の材料が容易にcryotomeで切断することができなかったとして、様々なサンプリング方法がそのまま口腔バイオフィルムを得るために検討された。これらのアプローチの最も有効なのは、この通信で表示されます。バイオフィルムを運ぶアクリル樹脂の小さなフレークは、バイオフィルムの構造を傷つけないように注意しながら、滅菌メスでこすり取った。鉗子は、鋼表面からバイオフィルムを収集するために使用された。が収集されると、サンプルは固定されており、polysineコーティングされたガラススライド上に直接配置されました。 FISHは、プローブのmで、これらのスライド上で直接実行され上記entioned。様々な魚のプロトコルは扱いやすくなった新しいプロトコルを作成するために結合し、変更されました。5,10,14,15その後試料は共焦点レーザー走査顕微鏡によって分析した。よく知られている構成は3,4,16,17は、チャネルによって浸透し球状の細菌のマッシュルームスタイルの形成およびクラスタなど、可視化することができます。さらに、これらの典型的なバイオフィルムの構造の細菌の組成を分析し、2Dと3D画像が作成されました。

我々は、と矯正装置から自然口腔バイオフィルムの構造と組成分析のためのプロトコルを提示<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）と共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）。口腔バイオフィルムのサンプルは、その表面からアクリル樹脂フレークをこすると分子の処理のためにそれらを参照して、口蓋パンダから採取した。

天然の不均一なバイオフィルムの共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）観察は、今日、広範な染色技術によって容易になっており、その一つに...

この手順の全体的な目的は、蛍光in situハイブリダイゼーションに使用するための天然の口腔バイオフィルムを、腭拡張装置から回収することです。まず、患者から4か月間蓄積されたバイオフィルムを含む腭拡張装置を取り外します。次に、バイオフィルムを含むアクリル樹脂の破片を腭拡張装置から掻き取ります。次に、固定したバイオフィルムの蛍光in situハイブリダイゼーションを、コーティング済みスライド上で直接行います。最後に、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、染色されたバイオフィルムの解析を行います。最終的に、蛍光in situハイブリダイゼーションと共焦点レーザー走査顕微鏡により、細菌バイオフィルムコミュニティの構造と組成が示されます。私たちは、矯正用拡大装置に肉眼で確認できる厚いバイオフィルムが付着していることに気づいたとき、初めてこの手法を考案しました。これにより、それらと歯周病との間に考えられる関連性について検討しました。この手法は、天然の口腔内バイオフィルムの空間的配置や組成など、口腔微生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手法は学際的なものであり、異なる専門家による共同作業が必要です。まず、エリザベスは矯正歯科医であり、バーバラは分子生物学の研究員です。開始にあたり、NOLAドライフィールドシステムを用いて、口腔内表面での4ヶ月間の処置後、汚染を防ぐために固定式口蓋拡張装置を隔離します。滅菌済みのプライヤー、手袋、およびトレイを使用して、患者の口から装置を取り出します。試料を120 mLのバイアルに入れ、-20 °Cで保存します。氷上に保持して研究室へ運び、24時間以内に検体を固定処理してください。滅菌済みのメスでバイオフィルムの片片を掻き取るか、滅菌済みのピンセットで破片を回収します。バイオフィルム構造を氷冷下で維持するためには、十分な厚みのアクリル樹脂フレークを掻き取ることが極めて重要です。サンプルが十分に浸るまで4%パラアルデヒド溶液を加えます。この混合物を4 °Cで3〜12時間インキュベートします。固定時間を長くしたり、固定温度を高くしたりすると、グラム陰性細胞の細胞包膜のオリゴヌクレオチドプローブに対する透過性が低下することがあります。インキュベーション後、パラアルデヒド溶液を除去し、氷冷した1x PBSで洗浄します。残留パラアルデヒドを除去するためにこの手順を2〜3回繰り返します。その後、サンプルを同量の氷冷1x PBSに懸濁し、同量の氷冷96% ethanolを加えて、サンプルを-20°Cで保存します。サンプルを脱水させるために、数ヶ月から数年間にわたって保存することが可能です。まず、パラアルデヒドで固定したサンプル材料を5〜30 µL、顕微鏡スライドガラスに塗布します。リゾチームとフォルマイドによって細胞壁が部分的に分解されるまで、46 °Cで15分間、または室温でより長い時間をかけてサンプルを乾燥させます。プローブの浸入を改善するため、1 mg/mLのリゾライム溶液を250 µL加え、室温で10分間放置します。その後、スライドを50%、80%、96%のエタノールに順に各3分間浸します。このエタノール濃度系列による脱水効果で膜が崩壊し、オリゴヌクレオチドプローブの取り込みが向上します。最後に、スライドを46 °Cで乾燥させ、in situ Uハイブリダイゼーションを行います。まず、新鮮なハイブリダイゼーションバッファーを1 mL調製し、47 °Cに予熱します。オリゴヌクレオチドプローブ溶液を氷上で解凍し、遮光して保存します。正方形のシャーレにティッシュペーパーを敷き、ハイブリダイゼーションバッファー800 µLをティッシュペーパー上にピペッティングします。バッファーにホルムアミドが含まれているため、すぐにチャンバーを再び閉じます。ハイブリダイゼーションバッファーの残りの200 µLに、各プローブを2 µLずつ加えます。よく混ぜ合わせ、顕微鏡スライド上の脱水済みサンプルに混合液を塗布します。すぐにスライドをディッシュに水平に置き、蓋をします。ディッシュをオーブンに入れ、46 °Cで1〜5時間インキュベートします。このディッシュは保湿チャンバーとして機能し、スライドからのハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防ぎます。特に、ホルムアミドが蒸発すると、非標的細胞へのプローブの非特異的結合を引き起こす可能性があります。50 millilitersの洗浄バッファーを調製し、ウォーターバスで48 degrees Celsiusに予熱します。ハイブリダイゼーションオーブンからスライドが入ったディッシュを取り出します。直ちに少量の予熱した洗浄バッファーでハイブリダイゼーションバッファーを洗い流し、スライドを残りの洗浄バッファーに移します。洗浄バッファーとスライドが入ったチューブをウォーターバスに戻し、48 degrees Celsiusで10～15分間インキュベートします。複数のプローブを用いてサンプルを染色する場合、洗浄バッファーを除去した後、前述の手順を繰り返します。この際、低濃度から高濃度の順に開始するように注意してください。その後、チューブからスライドを取り出し、氷に浸します。冷えた二度蒸留水で2〜3秒間洗浄します。残留している洗浄バッファーを除去するため、スライドをできるだけ速くエアドライさせます。速乾させることでプローブの解離を抑制できます。乾燥させたスライドは、プローブによる蛍光信号の著しい低下なく、－20°Cの暗所で数週間保存できます。サンプルをイメージングするには、スライドの左右端付近にAntifa試薬を2滴滴下し、カバーガラスを被せます。適切なフィルターまたはレーザーを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡でサンプルを観察します。スライドは4°Cで最大7日間保存するか、あるいは二回蒸留水で洗浄して－20°Cで長期間保存することが可能です。これは、固定式矯正装置のバイオフィルムを可視化する手法です。コーティングされたガラススライド上に直接ハイブリダイゼーションさせることが可能な適切な剥片を採取します。これにより、口腔マイクロバイオームの異なるグループや、三次元構成における細菌を特異的プローブを用いて同定できます。この図では、バイオフィルムをEUBミックスおよびLGCミックスで染色しており、黄色および青色で染色されたものに対し、緑色に現れているものが強く染色されています。ここでは、バイオフィルムをEUB mix back 3 0 3およびpogiで染色しました。bacteria dts群の細菌はピンク色およびpoor fireに現れます。R. gingivalisは、3種類のプローブすべてがそのDNAに結合し、色が重なり合って白いシグナルとなるため、黄白色に示されます。形態学的。細菌群間の差異や、球状菌の巨大なクラスターなどの特定の構造を同定することも可能です。ここでは、EUB mixを用いて染色した際のこのようなクラスターの例を示しています。さらに、CLSMデータの3Dモデリングを行うことで、バイオフィルムの典型的なキノコ状構造を処理することができます。これはEUB混在染色バイオフィルムの3Dアニメーションです。この手法により、矯正治療によって誘発されるバイオフィルム形成についての知見を得ることができます。また、病原性を持つ可能性のある複雑なバイオフィルム構造を伴う、人体内のその他のあらゆる人工表面にも適用可能です。このビデオを視聴することで、蛍光in situハイブリダイゼーションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡観察に向けた、天然の口腔バイオフィルムの調製方法について十分に理解できるはずです。これは学際的な分野であり、チームとして取り組んで初めて成果が得られることを忘れないでください。したがって、常に同僚に対して礼儀正しく接するようにしてください。

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蛍光in situハイブリダイゼーションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡による口蓋パンダの口腔バイオフィルムの解析

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