の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

この手順の全体的な目標は、細胞内カルシウム変化の光学イメージングにより、ショウジョウバエとアンテナ葉の嗅覚ニューロンの生理学的活動を測定することです。これは、最初に取り付けブロックのワイヤーホルダーとアンテナシールドを組み立てることによって達成されます。次に、蛍光カルシウムセンサーGCaMPを発現させたハエをブロックに装着して固定します。

フライが取り付けられると、フライヘッドの上部にあるキューティクルが切り取られ、アンテナローブが露出します。手順の最後のステップは、フライを顕微鏡の下に置き、臭いで刺激することです。最終的には、カルシウムセンサーGキャンプの相対蛍光の記録された変化を通じて、DLAアンテナローブの臭気誘発活動パターンを示す結果を得ることができます。

この方法は、嗅覚回路のさまざまなレベルで、匂いが神経活動の空間的および時間的パターンとしてどのように表されるかを明らかにするのに役立ちます。この手法が電気生理学などの他の方法よりも優れている点は、記録電極にアクセスできない遺伝的に同定されたニューロンの活動を記録できることです。しかし、この方法は匂いの神経処理についての洞察を提供することができます。

また、聴覚系やガス系など、脳の他の領域にも適用できます。まず、ネジをプレキシガラス取り付けブロックの背面に通し、ネジが前面からはみ出さないようにします。精密ドリルを使用して、フライ用の円形チャンバーの上部境界にへこみを作り、表面の下を掘り、ブロックの厚さを減らします。

解剖スコープの下で、メスで銅のグリッドを垂直にスリットの底に近くカットして、フライを保持するためのカラーを作成します。結果として生じる2つのフラップが水平であることを確認して、フライの挿入を助けます。つまようじを使用して、円形チャンバーの上の取り付けブロックに瞬間接着剤を少し落とします。

フライの場合は、銅のグリッドを接着剤の上に置き、スリットがブロックの中央に来るように配置します。グリッドをそっと押し下げ、ピンセットで余分な接着剤を取り除きます。両側のフラップの下に小さな接着剤を滴下し、スリットがまっすぐ下を向くようにブロックの前面にグリッドを折ります。

グリッドの上部がブロックと同じ高さにあることを確認し、完全に乾かします。ワイヤーホルダーを作るには、プラスチックカバースリップを半分に切り、中央のピースを取り外してU字型にします。蜜蝋を使用して、ワイヤーがtになりすぎないように、Uの上部にワイヤーを接着します。

紙の穴あけパンチを使用してプラスチックカバーのスリップに穴を開けてアンテナシールドを構築します。カバースリップの端を0.5×0.7センチメートルにトリミングします。ピアスをしたプラスチックカバースリップを粘着テープに接着し、穴から露出したテープにエタノールを一滴垂らします。

接着剤を除去するには、適切な遺伝子型の1〜3週齢のハエを氷上で冷却して麻酔します。解剖スコープの下で、翼のジョイントでハエを拾い上げ、最初に銅グリッドに沿って背側表面をスライドさせて、首に吊り下げます。必要に応じて、フライが下を向くまでフライを回転させます。

ハエの頭の前に細いサボテンの背骨を置いて逃げないようにし、背骨をプロボスの前に配置してハエが動かないようにします。蜜蝋を使用してサボテンの背骨をブロックに固定し、頭のてっぺんがブロックの上部と同じ高さであることを確認します。エタノールに溶かしたロジンの小さな滴でハエの頭をブロックに固定します。

ブロックを加湿ボックスに入れ、ロジンを約1時間硬化させます。鉗子を使用して、アンテナプレートを前方に引き、ワイヤーホルダーをアンテナとヘッドの間のクチクラ折り目に落とします。ホルダーをブロックの前面にさらに蜜蝋で固定します。

ブロックに組み込まれているネジを使用して、ワイヤーホルダーをゆっくりと前方に押し、アンテナプレートとヘッドの間にスペースを作ります。アンテナシールドをハエの頭のてっぺんに置き、全体を中央に置きます。シールドを蜜蝋で取り付けブロックの上部に固定します。

ブレードスプリッターを使用して、シールドのテープに小さな穴を開け、アンテナの後ろにあるフライヘッドのキューティクルを露出させます。穴は、製剤が漏れるのを防ぐために、目を超えて伸びないようにする必要があります。テープとキューティクルの間の穴を2液型シリコンで塞ぎます。

フライヘッドの上部から余分なシリコンを取り除きます。ショウジョウバエのリンガー生理食塩水をハエの頭に一滴垂らし、漏れがなく、アンテナが完全に乾いたままであることを確認します。サファイアブレードを使用して、アンテナのすぐ後ろのクチクラの折り目に沿って軽くスコアを付けます。

次に、目に沿って、背面のセリを横切って切ります。最後に、スコアリングされた端にキューティクルを折り、下側から切り取ります。アンテナ神経を切断しないように、細いピンセットで腺と気管を慎重に取り除きます。

ショウジョウバエのリンガー溶液で繰り返しすすぎ、頭に大きな滴を残します。セルロースパッドを清潔な鉗子で2ミリリットルのプラスチック注射器に挿入します。ろ過したピペットチップを使用して、20マイクロリットルの希釈した臭気物質を塗布します。

イメージングに必要になるまで、シリンジを差し込んでキャップします。フライを含むマウントを顕微鏡下に置きます。フライの頭のリンガーソリューションに触れるまで、目標を下げます。

明視野照明の下でビューアを通して見ながら、ヘッドカプセルの穴が中央に配置され、その境界に焦点が合うように調製物を配置します。蛍光灯に切り替えて、GCaMPの基底的な緑色の蛍光から明らかなはずの標識されたニューロンが見えるまで焦点を調整します。適切な取得ソフトウェアを使用して顕微鏡に取り付けられたCCDカメラで画像を取得し、目的の糸球体に焦点を合わせます。

照明光路の絞りを必ず閉じて、励起光が撮像領域に制限されるようにしてください。嗅覚計の出口をハエのアンテナの約0.5センチメートル前に配置します。ここでは、肛門葉は、1%プロピオン酸によるいくつかの糸球体刺激で発現を駆動する嗅覚ニューロンプロモーターの制御下でGCaMP 1.6を発現するハエで示され、細胞内カルシウムの増加を示すGAMP蛍光の増加を誘発し、嗅覚ニューロンでは、神経支配糸球体、DC 4およびDP one L.プロピオン酸に対する糸球体DC4およびDP one Lのカルシウム応答の時間的ダイナミクスがここに示されています。

黒いトレースは、8 匹の動物にわたる関心領域内の F に対する Delta F の平均の中央値を示し、灰色の表面は分布の 1 番目と 3 番目の四分位数の間の範囲を示しています。以下のヒートマップは、個々の動物の反応を示しています。緑色のマゼンタのボックスは、GCaMPのベースライン蛍光レベルを超える糸球体のピーク応答を計算するために平均化されたフレームを示しており、ここでは定量化されて示されています。

蛍光レポーターの漂白を補正すると、応答に影響を与える可能性があります。左パネルのピークサンプルデータは、レスポンスの形状を大きく変えることなく補正できます。見本。右パネルのデータは、漂白剤補正の影響を大きく受けますが、これはおそらく、臭気刺激の終了後に信号が低下し、ベースライン以下に維持されるため

適切に実行された場合 この手順を試みるときは、アンテナを完全に乾いた状態に保つことが重要です。そうしないと、アンテナは臭いを検出できなくなります。このビデオを見た後。画像の準備方法と臭いの分析方法についてよく理解している必要があります。

ショウジョウバエの神経活動を呼び起こします。