Name: の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶショウジョウバエ触角葉における臭気誘発カルシウム応答の光学イメージング法。GCaMPを用いて嗅覚ニューロンの活動パターンを可視化し、神経回路における臭気処理メカニズムを解明します。

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我々は図1の回路図を使用するための取り付けブロックの青写真とダニエラ·ペルツを描画するためのパブロTraversa、この方法論の開発にジルケSachseとベアテEisermannを認める。私たちは、原稿上のコメントのジルケSachse、パヴァーヌRamdyaとラファエルRytzに感謝しています。 R.ベルは、ベーリンガーインゲルハイム財団博士フェローシップでサポートされています。 R.ベントンの研究室での研究は、独立した研究者グラントとスイス国立科学財団を起動する欧州研究評議会によって運営されている。

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著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明した準備や分析方法は、対応するドライバの導入遺伝子が利用可能である触角葉（OSNs、LNとPNS）の神経細胞のいずれかの集団で臭気誘発応答を分析するために使用することができます。我々は蛍光顕微鏡を使用してアプリケーションを記述しながら、本製剤の光イメージングが均等に焦点または二光子顕微鏡22,32を用いて行うことができる。実際、これらの後者の楽器は、ニューロンExpressの場合は特に、多数のレポーター、画像の解像度を減らすことができる広視野顕微鏡の光散乱問題を軽減する。この製剤は、通常、少なくとも半時間臭気誘発応答の録音を許可しますが、この時間は、記録された測定値の数と長さに応じて各フレーム間の刺激間隔に使用される露光時間大幅に長くしたり短くすることができます。さらに、二光子励起、蛍光repの退色を減らすことができますorterと同様に、細胞の毒性は、長い期間にわたって測定22,32を許可します。 かかわらず、顕微鏡の選択の、頭部カプセル内のハエの脳の動きは時に無傷の動物のイメージング最も再発の問題です。動き補正はマイナーな問題を（ステップ5.1）修正することができますが、それは非常に安定した調製物から録音する方が良いだけです。動きのアーチファクトを低減するための戦略は、（i）適切にサボテンの棘を持つハエの口吻を抑制すること、（ii）エイコサン（前の2.6ステップ）（エイコサンがで溶融させることができるとステージに固定することにより、ハエの脚を固定する〜 37°C;）この目的のためはんだごての先端を拡張し、洗練するために銀線を使用すること、（iii）微細なピンセットを用いて食道を（触角神経の間に表示されます）ニッキング。 ここで使用されるG-CaMP1.6に加えて、G-cAMPおよび他のカルシウム指標の最適化バージョンの数は、ご利用いただけますこれは、それらの信号対雑音比は、ベースラインの蛍光および時間的ダイナミクス12,28,33が異なります。センサの正確な選択は、アカウントにこれらのすべてのプロパティは、ニューロンのタイプを分析すると生物学的な問題が対処されているを取る必要があります。電流センサは、活動電位12,34とかなりよく相関カルシウムの変化を報告し、特定の遺伝子のドライバー·ライン数の増加35と結合し、その更なる向上は、そのままその場で神経活動の光学的イメージングの可能性を強化していきます。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬</td><td>サプライヤー</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>サボテン棘</td><td>ガーデンセンター</td><td></td><td>あまりにも柔軟性がない、〜7ミリメートル長い薄い</td></tr><tr><td>ロジン</td><td>弦楽器店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二成分シリコン</td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td>カスタムブロックを取り付けプレキシガラスを作った</td><td>から入手可能な青写真<a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>銅グリッド</td><td>アテネグリッド</td><td> G220-5 </td><td>通常は電子顕微鏡の試料に使用されます。 </td></tr><tr><td>ネジ</td><td>金物店</TD&gt; <td></td><td>直径2mm </td></tr><tr><td>プラスチック製カバースリップ</td><td>プラノ-EM </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22ミリメートル</td></tr><tr><td>はんだごてのヒント</td><td>コンラッドエレクトロニクス</td><td> 830283から62 </td><td></td></tr><tr><td>調整電源</td><td>コンラッドエレクトロニクス</td><td> 511407から62 </td><td></td></tr><tr><td>細い線</td><td> Isabellenhütte </td><td> ISA-Ω </td><td> 0.013ミリメートル</td></tr><tr><td>エイコサン</td><td>シグマ</td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axioexaminer D1の</td><td></td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td>集録ソフトウェア</td></tr><tr><td>単色光分光器</td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td>壊れやすいブレード</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10050から00 </td><td></td></tr><tr><td>ブレードホルダー</td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td>サファイアブレード</td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td>ダブルブレード1mmの縁取り</td></tr><tr><td>膜のガスポンプ</td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td>サファイアブレードホルダー</td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td>三方弁</td><td>リー·カンパニー</td><td> LFAA1200118H </td><td>設定E </td></tr><tr><td>浮子式流量計500ミリリットル/分</td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td>浮子式流量計5 L / minの</td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td>蜜ろう</td><td> Siladent Technikで</td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td>セルロースパッド</td><td> Kettenbach医療</td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>プラノ-EM </td><td> T5130 </td><td>デュモン生物学第5位</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ミリリットル、Discardit II、2個入り</td></tr><tr><td>針</td><td>ブラウンSterican </td><td> 4665120 </td><td> 1.2ミリメートルOD </td></tr></tbody></table>

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

触角葉、昆虫脳内の主要な嗅覚中枢であり、脊椎動物の嗅球1-5の解剖学的および機能的に同等を表しています。外界の嗅覚情報は、それらが表現する特定の嗅覚受容体に応じて糸球体と呼ばれる神経網の異なる領域に分離する嗅細胞（OSNs）によって触角葉に送信されます。ここでは、より高い嗅覚脳領域への嗅覚情報を伝えるため、両方のローカルプロセス多くの異なった糸球体を支配することができます介在（LNS）と、投射ニューロン（PNS）とOSN軸索のシナプス。 触角葉におけるOSNs、LNSとPNの活動の光学的イメージング - 伝統的に合成カルシウム指標（例えば、カルシウム、緑、FURA-2）または電位感受性色素（例えばRH414）を使用して - 長い理解することが重要な技術であった方法嗅覚刺激が空間的および時間的パターンとして表されます。昆虫6-10の多くの種における糸球体の活動。このような蛍光カルシウム指標G-CAMP 11,12とカメレオン13と遺伝的にエンコードされた神経活動の記者の開発、生物発光カルシウム指示薬GFP-エクオリン14,15、またはシナプス伝達のレポーター、synapto-pHluorin 16が行ったショウジョウバエの嗅覚系、神経イメージング、特にアクセスキイロショウジョウバエでは 、その包括的に記述され、分子の電気生理学的および神経解剖学的特性を2,4,17を補完する 。これらの記者は、選択的に臭気誘発方法、高空間分解能と時間分解能で詳細に分析する嗅覚回路内のニューロンの定義された集団でバイナリ転写制御システム（例えばGAL4/UAS 18、LexAの/ LexAop 19,20、Qシステム21）を介して表現することができる神経活動が表現され、変調されたと22から24 &lt;形質転換/&gt;のsup。 ここでは、G-CAMP 25から27を使用して、 ショウジョウバエの触角葉で匂い誘発反応を測定するための準備と分析方法について説明します。動物の準備は低侵襲で、広い視野、蛍光共焦点顕微鏡と二光子顕微鏡を用いたイメージングに適応することができます。

我々は生きているの触角葉で匂い誘発カルシウム応答を測定し、分析するための確立された技術を記述する<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;。

触覚葉は昆虫の脳における一次嗅覚中枢であり、脊椎動物の嗅球に解剖学的および機能的に相当する構造である。

この手順の全般的な目的は、細胞内カルシウム変化の光学イメージングにより、ショウジョウバエの嗅覚ニューロンおよび触角葉の生理学的活性を測定することです。まず、マウンティングブロックのワイヤーホルダーと触角シールドを組み立てます。次に、蛍光カルシウムセンサーGCaMPを発現しているハエをブロックに装着し、固定します。ハエを固定した後、ハエの頭頂部のクチクラを切り取り、触角葉を露出させます。手順の最終ステップは、ハエを顕微鏡下にセットし、臭気で刺激することです。最終的に、カルシウムセンサー G camp の相対蛍光強度の変化を記録することで、DLA 触角葉における臭気誘発性の活動パターンを示す結果を得ることができます。本手法は、嗅覚回路の異なる階層において、臭いが神経活動の空間的および時間的パターンとしてどのように表現されるかを明らかにするのに役立ちます。電気生理学などの他の手法に対する本技術の主な利点は、記録電極ではアクセスできない、遺伝的に特定されたニューロンの活動を記録できる点にあります。これにより、臭いの神経処理に関する知見を得ることが可能です。これは、聴覚系や嗅覚系など、joof脳の他の領域にも適用可能です。まず、ネジをプレキシガラス製マウントブロックの背面から通し、前面に飛び出さないようにします。精密ドリルを使用して、ブロックの表面下を掘り下げて厚みを薄くし、フライ用の円形チャンバーの上端にくぼみを作ります。解剖顕微鏡下で、銅グリッドをスリットの底に近い部分で垂直にメスで切り、ショウジョウバエを固定するためのカラーを作成します。このとき、できた2つのフラップが水平になるようにしてください。これにより、ハエの挿入が容易になります。つまようじを使用して、円形チャンバー上のマウンティングブロックに少量の瞬間接着剤を滴下します。フライについては、銅製グリッドを接着剤の上に置き、スリットがブロックの中央にくるように配置します。グリッドを軽く押し付け、はみ出した接着剤をピンセットで取り除きます。両側のフラップの下に少量の接着剤を加え、スリットが真下を向くようにグリッドをブロックの前面に折り曲げます。グリッドの上端がブロックと水平であることを確認し、完全に乾燥させます。ワイヤーホルダーを作成するには、プラスチック製のカバーガラスを半分に切り、中央部分を取り除いてU字型にします。ミツロウを使用して、U字の上部にワイヤーを接着し、ワイヤーが張りすぎないように固定します。プラスチックカバースリップにパンチで穴を開け、アンテナシールドを作成します。カバースリップの端を0.5 by 0.7 cmに切り揃えます。穴を開けたプラスチックカバースリップを粘着テープに貼り付け、穴から露出しているテープの上にエタノールを1滴滴下します。接着剤を除去するため、適切な遺伝子型の齢1〜3週のハエを氷上で冷却して麻酔します。解剖顕微鏡下で、ハエを翅の関節部分で持ち上げ、背側を先に銅グリッドに沿わせて滑らせ、頸部で吊り下げられた状態にします。必要に応じて、ハエが下を向くまで回転させます。ハエの頭部の前に細いサボテンの棘を配置して脱走を防ぎ、さらに口吻の前に棘を配置して動きを制限します。頭頂部がブロックの上面と水平になるように注意しながら、蜜蝋を用いてサボテンの棘をブロックに固定します。エタノールに溶解した少量のロジンを用いて、ハエの頭部をブロックに固定します。ブロックを加湿ボックスに入れ、ロジンを約1時間硬化させます。ピンセットを使用して、触角プレートを前方に引き、触角と頭部の間の角質層の折り目にワイヤーホルダーを落とし込みます。さらに蜜蝋を用いて、ホルダーをブロックの前方に固定します。ブロックに組み込まれているネジを使用して、ワイヤーホルダーをゆっくりと前方に押し、アンテナプレートと頭部の間に隙間を作ります。アンテナシールドをハエの頭部の上に置き、全体が中心に位置するようにします。ミツロウを用いて、シールドをマウントブロックの上部に固定します。ブレードスプリッターを用いて、シールド上のテープに小さな穴を開け、触角の背後にあるショウジョウバエ頭部の角質層を露出させます。調製物が漏れ出すのを防ぐため、穴が眼まで達しないようにしてください。テープと角質層の間の穴を、2液性シリコンで密封します。ショウジョウバエの頭部上端から余分なシリコンを除去します。ショウジョウバエの頭部にドロソフィラ・リンガー液を1滴滴下し、液漏れがなく、触角が完全に乾いた状態であることを確認します。サファイアブレードを用いて、触角の直後にあるクチクラの折り目に沿って軽く切り込みを入れます。次に、眼に沿って、および背面のセリ（selli）を横切るように切断します。最後に、切り込みを入れた縁に沿って角質層を折り曲げ、裏側から切断します。触角神経を切断しないよう、精密ピンセットを用いて腺と気管を慎重に取り除いてください。Drosophilaリンガー液で繰り返し洗浄し、頭部に大きな液滴を残します。清潔なピンセットを使用して、2 mLのプラスチック製シリンジにセルロースパッドを挿入します。フィルター付きピペットチップを用いて、希釈した誘引物質を20 µL添加します。イメージングの準備が整うまで、シリンジにプラグとキャップをしてください。ハエを固定したマウントを顕微鏡下に設置します。対物レンズを、ハエの頭部のリンガー液に触れるまで下げてください。明視野照明下で接眼レンズを覗き、頭部カプセルの孔が中心に位置し、その境界にピントが合うように試料を配置します。蛍光灯に切り替え、GCaMPの基底緑色蛍光により視認できる標識ニューロンが見えるまでピントを調整します。顕微鏡に搭載されたCCDカメラと適切な撮像ソフトウェアを用いて画像を取得し、目的の糸球体にピントを合わせます。励起光をイメージング領域のみに制限するため、照明光路の絞りを必ず閉じてください。嗅覚計の出口を、ハエの触角の前約0.5センチメートルの位置に配置します。ここでは、複数の糸球体で発現を誘導する嗅覚感覚ニューロンプロモーターの制御下でGCaMP 1.6を発現しているハエにおいて、分析葉が示されています。1% propionic acidによる刺激により、糸球体DC4およびDP1Lに分布する嗅覚感覚ニューロン内でGCaMP蛍光が増加し、細胞内カルシウム濃度の上昇が示されています。ここでは、propionic acidに対する糸球体DC4およびDP1Lのカルシウム応答の経時的ダイナミクスが示されています。黒い線は、8匹の動物における関心領域内の平均ΔF/Fの中央値を示しており、灰色の領域は分布の第1四分位数から第3四分位数までの範囲を示しています。下のヒートマップは、個々の動物の応答を示しています。緑色の枠で囲まれたマゼンタ色のボックスは、GCaMPの基線蛍光レベルを超えた糸球体のピーク応答を算出するために平均化したフレームを示しており、ここではその定量化された結果が表示されています。蛍光リポーターの退色補正は、応答に影響を及ぼす可能性があります。左パネルのピークサンプルデータは、応答の形状を大きく変えることなく補正することが可能です。右パネルのサンプルデータは退色補正による影響を強く受けていますが、これはおそらく、臭気刺激の終了後に信号が低下し、ベースライン以下で維持されるためと考えられます。この手法に習熟すれば、約30分で完了させることができます。本手順を正しく行う際、触角を完全に乾燥した状態に保つことが重要です。そうしないと、臭気を検知できなくなります。このビデオを視聴することで、イメージの準備および臭気分析の方法について十分に理解できるはずです。ショウジョウバエにおいて神経活動を誘発します。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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3齢ショウジョウバエmelanogaster幼虫における嗅覚回路ニューロンの生体内および生体外カルシウムイメージング

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の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

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