Name: 機能心臓の免疫細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶ心臓免疫細胞の単離法。ラット心膜腔からHBSS灌流・吸引で機能的免疫細胞を収集し、コラゲナーゼ消化による活性化を回避。フローサイトメトリーなどの解析に適した細胞を得られる。

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この作品は、UNCF -メルク大学院科学研究論文フェローシップ（JLM）、国立心臓、肺、血液研究所の助成金RO1 - HL - 62228（JSJ）とRO1 - HL - 073990（JSJ）によってサポートされていました。

1。ハンクスバランス塩溶液の調製（HBSS） <ol><li>オートクレーブ1Lのガラスビーカー、1000mLのはメスシリンダー、そしてバーをかき混ぜる。 </li><li>再蒸留水で900mLのマークにオートクレーブ1リットルのガラス製ビーカーにHBSS粉のソリューションを再構築。 </li><li>ヘペスのNa +塩3.4 gをとりHBSS溶液を混和し、濃塩酸や水酸化ナトリウムのいずれかを使用して7.35から7.41の間の値にpHを調整する。 </li><li>所望のpHが達成し、安定した状態でされると、アルブミンが完全に溶解するまで室温で溶液にウシ血清アルブミン5gを加える。 </li><li>総量1000 mlのマークになるまでのソリューションに、antimyotic、抗生物質と蒸留水10 mLを加え。 </li><li>徹底的に解決策をかき混ぜる。 </li><li> HBSS溶液をフィルタリングし、後で使用するために50mlのファルコンチューブに分離。追加のチューブが凍結し、後日使用することができます。 </li></ol> 2。動物PreparatioN - 気管チューブの挿入<ol><li>気管チューブ（すなわち、鉗子、はさみ、気管チューブは3-0の黒い編み糸、小動物の人工呼吸器、等）の挿入のために必要な機器や材料でトレイを準備します。 </li><li>ラットは1キシラジン〜2ケタミンの割合でケタミン/キシラジンカクテルと完全に麻酔になると、ラットの腹部、胸部、そして喉を削る。深い麻酔状態が達成されていることを保証するために、ラットのつま先をつまむと四肢のペダルの撤退を確認してください。ラットは、すべての切開を行う前に、深く麻酔であることを確認します。 </li><li> 30 °の角度で傾斜したまな板の上上げ、その頭を持つネズミを配置</li><li>半ば腹部から下顎下に皮膚切開を行います。気管を露出させる前頸三角の筋を離れて解剖。 </li><li>気管の下に3から0黒い編み糸を置きます。 </li><li>軟骨環の間の気管の切開を加えますD気管チューブを挿入します。気管に気管チューブを固定するために緊密に縫合糸を結びます。 </li><li>小動物の人工呼吸器に気管チューブを接続します。 </li></ol> 3。免疫細胞分離のための計器の準備<ol><li>免疫細胞の単離法のための機器（すなわち、鉗子、はさみ、HBSS、針クイックカテーテルを介してソフトテフロン24ゲージバクスター血管内をトリミング）してトレイを準備します。 </li><li> two 10ccの注射器を準備し、心膜嚢と予備のセルを含むHBSSを吸引するためのもう一つのバッファを導入するためのHBSSを使用すると、ワンシリンジを埋める。 3.2.1。分離の手続きのための元の長さの1 / 2〜3 / 4針クイックカテーテル（1.6センチ）以上の24ゲージバクスター血管内のテフロンチップを減らす。 </li><li>すべての注射器、バッファ、および空の15 mLのファルコンチューブ（手続きが終了後、抽出液を保持するため）氷の上に置きます。 </li></ol> &lt;Pクラス="jove_title"&gt; 4。免疫細胞分離<ol><li>あなたが剣状突起に到達するまで腹壁（白線に沿って）に正中切開を加えます。 </li><li>剣状突起にわずかに横方向の開始、腋窩に向かって斜めに継続的な胸郭を通じて二国間の切開を行います。肺、心臓、または心膜を穿孔しないように注意してください。 </li><li>胸骨の両側の切開が完了したら、内側の側面切削、下部肋骨からダイアフラムを離れて解剖。 注意：心膜が損傷を避けるためにダイアフラムと胸骨に接続されている箇所の今まで注意してください。心膜はダイアフラムの反対側に接続されている場所に注意するランドマークとして、肝鎌状間膜を使用してください。心膜が切断された場合も、細胞を単離する能力は失われます。 </li><li>ゆっくりと胸腔と心を（まだ心膜でカプセル化された）公開する胸郭の片側を持ち上げて。</li><li> HBSSにシリンジを取ると心膜嚢のポイントを見つける胸骨と心臓の間に約半分の方法を（好ましくは吻側尾側より）と心の両方の層を介し短縮クイックカテーテルのテフロンチップを挿入。 </li><li>カテーテルを設置したら、HBBSバッファの2〜3mlで心膜腔を埋める優しく進んでください。あなたが心膜腔が拡大して気づいたときにカテーテルが適切に配置されている場合は、すぐにわかります。ない充填が目撃されていない場合は、クイックカテーテルを撤回し、再配置。 </li><li>心膜嚢がいっぱいになると、他の10 ccシリンジを取ると心に戻って先端を配置し、バッファーを吸引開始。同じエントリの穴を使用することができますまたは別のを作成することができます。特に心臓の下側に、吸引を提供しながら、先端は心膜嚢の壁に近すぎて来ていないことを確認してください。これは、細胞含有細胞の心膜嚢と損失を穿刺する可能性がありますS. </li><li>バッファーを吸引しながら、カテーテルの先端はできるだけ多くのバッファを収集するために、心膜の内部を移動することができます。 </li></ol> 注：もしあなたが少し心を引き裂き、元の穴より大きい心臓の上部に穴を開けて、そうすることで、慌てる必要はありません。限り、心膜はまだ十分な心のを囲むようにあなたはまだバッファより少ない量ではあるが、心臓を経由して別の洗浄を行うことができます。細胞の最適な量のコレクションの場合、3〜4追加の洗浄が必要である。 <ol start="9"><li>氷の上に配置されたファルコンチューブに抽出されたバッファに置きます。 </li><li>さらなる研究のために必要な場合は心臓、肺、および/またはその他の組織を削除します。免疫細胞と他の組織の集まりの後、ラットは、迅速かつ人道的に安楽死でなければならない。 </li><li> 4で200グラム℃で10分間のために収集された免疫細胞のサンプルを遠心常に氷上でチューブを保持しないときは、使用中である。 </li><li> HycloneバッファまたはHBSSを1 mLの上清と再構成ペレットを取り外します。 </li></ol> 注：免疫細胞の単離手順の後、各心臓から得られる免疫細胞の数をカウントすることが重要です。 5。代表的な結果： トルイジンブルーおよびサフラニンO /アルシアンブルーで、この手法で染色を用いて得られた分離された心臓の肥満細胞の例はそれぞれ、図2Aおよび2Bに示されている。図3に、心臓のマストに見られるように、そのような化合物の80分の48とモーガンらに説明されているようにサブスタンスPとして知られている活性剤で処理した後にヒスタミンを放出する能力を維持した。CD4のフローサイトメトリーから9代表的な散布図+細胞はとCD8 +細胞は、それぞれ図4および図5で提示されています。 T -リンパ球は、さらにこの技術から細胞集団として同定と表現型されています。 心臓の免疫細胞の単離手順の図1。フローチャート。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg"> トルイジン青（）と（B）サフラニンO /アルシアンブルーである： 図2心臓の肥満細胞の組織学的代表的なイメージは次のように染色されています。。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg"> 図3。心臓の肥満細胞の機能研究心外膜心筋部位から分離し、化合物80分の48（10μg/mL）およびサブスタンスP（10μM）で刺激した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg"> 図4。分離されたCD4 +細胞のサブスタンスP（1:100 dilutで標識の代表的なフローサイトメトリーの散布図イオン）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg"> 図5。サブスタンスP（1:100希釈）で標識単離したCD8 +細胞の代表的なフローサイトメトリー。

<ol><li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li>
<li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li>
<li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li>
<li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li>
<li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li>
<li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cells%3A+Versatile+regulator+of+inflammation%2C+tissue+remodeling%2C+host+defense+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li>
<li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li>
<li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-%C9%91+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-%C9%91%2C+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li>
<li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li>
<li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li>
<li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li>
<li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

心臓の免疫細胞を単離するこのメソッドは通常、伝統的な酵素消化の単離技術の間に発生する不要な活性化することなく、機能、表現型、および成熟度の分析を可能にします。この手法で得られた細胞の平均合計数は、ラットの心臓あたり約40万であり、そしてこれらの細胞の差の染色とフローサイトメトリー分析は、T -リンパ球の混合集団（〜70％）、マクロファージ（〜12％）と肥満細胞とを示しているこの技術の使用。（〜12％）13、その14は 、心臓の免疫細胞集団のさらなる分離のための精製法が必要とされています。単離された免疫細胞は、機能の研究、フローサイトメトリー、immunofluroescence、および共培養実験を含む複数のアプリケーションに使用することができます。さらに精製すると実験で、これらの単離された細胞は、心臓リモデリングの過程における免疫システムの役割を理解するための便利なツールを提供しています。 ラットは標準的な環境条件下で飼育し、商業ラット固形飼料および...

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬と機器の名称</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩</td><td>シグマ</td><td> H4891 </td><td> 1本のボトルにはハンクスバランス塩の1 Lになります ソリューション。再構成ハンクスバランス塩 手順の一部としてソリューション。 </td></tr><tr><td>抗生物質Antimyotic </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> 250mLのNalogeneフィルターボトル</td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 N HCL </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> 6 Nの場合は、脱イオンにHCLの同じボリュームを追加水。 </td></tr><tr><td> 10NのNaOH </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> SC267 </td><td> 5 Nの場合は、脱イオン水に水酸化ナトリウムの等量を追加。 </td></tr><tr><td>再蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>特定の機器の表： <table border="1"><tbody><tr><td>試薬と機器の名称</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td> 3 - O縫合シルク編組</td><td>エチコン製品</td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td>小動物の人工呼吸器</td><td> CWE株式会社</td><td> SAR - 830 </td><td>分あたり40.5呼吸する呼吸数を設定します。 </td></tr><tr><td>ベベル18ゲージの針</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 305199 </td><td>気管チューブとして使用するための元の長さの1 / 2〜3 ​​/ 4針をトリミング。 </td></tr><tr><td> 24ゲージバクスタークイックカテーテルカテーテルのテフロンチップ（針を除去したもの） </td><td>バクスター</td><td> 2N111 </td><td> 3 / 4〜1 / 2テフロンチップの長さを減らします。 </td></tr><tr><td> 10ccのシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14から823 - 16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 mLのファルコンチューブ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td>ソーバルRT6000B冷却遠心機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 75-004-377 </td><td>プレクールに覚えていると4で保つ℃、 </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td> Hausserサイエンティフィック</td><td> HS - LB - 1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

機能心臓の免疫細胞の単離

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

。心臓の免疫細胞は肥満細胞、T細胞およびマクロファージを含む1月5日 、これらの免疫細胞は、彼らは多くの心臓疾患の病理学的リモデリングにおいて果たす役割に関心を集めている、店舗やサイトカインを含む生物学的活性のメディエーターの様々を解放し、このようなトリプターゼとしてプロテアーゼ。6-8これらのメディエーターは、マトリックスメタロプロテアーゼの活性化や変調心臓線維芽細胞&quot;機能により、コラーゲンの蓄積を引き起こすことにより細胞外マトリックスの代謝に重要なプレーヤーであることが示されている。9-11しかし、心臓の免疫細胞を単離するために利用できる技術は持っている彼らは心筋組織を消化する細菌性コラゲナーゼを使用するため、問題となって。この手法は、免疫細胞の活性化とそのための機能が失われます。例えば、心臓の肥満細胞が脱顆粒を引き起こす化合物を大幅に軽減応答になる。12だから、我々はtを可能にする技術を開発彼の心疾患におけるこれらの細胞の役割の理解につながる機能性心臓免疫細胞の分離。13、14 このメソッドは、解剖学的なラットの剣状突起、腋窩および鎌状靱帯の位置、および心臓の心膜に精通している必要があります。これらのランドマークは、プロシージャの成功を増加させると心臓の免疫細胞のより高い利回りを確保することが重要です。これらの孤立した心臓の免疫細胞は、機能性、表現型、成熟度、および他の心臓の細胞との共培養実験その相互作用の理解を得るための特性評価に使用することができます。

心臓から機能的な免疫細胞を単離するためのこの方法では、これらの細胞の反応性の低下、その結果、不要な免疫細胞の活性化を引き起こすコラゲナーゼ消化、の従来の方法に代わる方法が用意されています。分離の手法は、酵素消化に関連する問題を回避することによって機能的な心臓の免疫細胞が得られます。

心臓の免疫細胞は、多くの心疾患における病理学的リモデリングで果たす役割から、関心が高まっています。1-5 これらの免疫細胞は、...

本手順の総合的な目的は、機能的な心臓免疫細胞を単離することです。まず、ラットに人工呼吸を行い、心臓を囲む心膜嚢を露出させます。次に、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を心膜腔に注入します。次に、心膜腔からの免疫細胞を含むHBSSを吸引します。最後に、分離手順で得られた免疫細胞数をカウントします。最終的に、心臓免疫細胞の機能性と生物学的活性を評価するために、化学的脱顆粒または共培養実験、フローサイトメトリー、免疫蛍光分析、あるいは細胞の薬理学的処置を行うことができます。私の研究室から3名がこの手順を実演します。大学院生のJennifer McLarty、ポストドクトラルフェローのGiselle Melendez、そしてチーフテクニシャンのSpencerです。コラーゲン消化などの既存の免疫細胞分離法と比較して、この手法の主な利点は、不要な免疫細胞の活性化や損傷を防ぎ、実験的処置に対する免疫細胞の応答性を維持できることです。開始する前に、カッティングボードを30度の角度に傾けてください。次に、ドレメル電動工具を使用して、18ゲージのベベル針の先端を半分から4分の3まで切り落とします。これは、ラットのモニタリング後に気管内チューブを使用するために、チップを短くするためです。十分な麻酔を確保するため、動物の腹部、胸部、および喉を剃毛し、その後、腹部中央から顎の下まで皮膚を切開します。次に、頸部の前三角の筋肉を剥離して気管を露出させ、露出後、その下に3-0の黒色編み込み縫合糸を配置します。続いて、気管の軟骨環の間に切開を加え、気管チューブを挿入します。気管チューブを固定するため、3-0の縫合糸を気管の周囲でしっかりと結紮します。次に、気管内チューブを小動物用人工呼吸器に接続し、呼吸を誘発させます。心臓と肺に十分な酸素が供給されていることを確認するため、人工呼吸器の吸気および呼気に合わせて、ラットの胸部が均等に上下していることを確認してください。免疫細胞の分離を開始する前に、10 cc シリンジに HBSS を満たしておきます。次に、24ゲージのBaxter社製血管内針上針カテーテル（Quick cath）の柔らかいテフロンチップの先端を1/2から3/4程度切り落とし、分離操作用にチップを短くします。この24ゲージのBaxter社製血管内針上針カテーテルを配置します。HBSSが入ったシリンジにカテーテルチップを素早く装着します。次に、HBSSを満たしたシリンジ、すべての緩衝液、および空の50 milliliterコニカルチューブを氷上に置きます。続いて、白線から剣状突起にかけて腹壁に正中切開を加えます。次に、剣状突起のすぐ外側から、肋骨を通り抜けるように両側に切開を加えます。肺、心臓、または心膜を傷つけないよう注意しながら、腋窩に向かう角度で切開を続けます。その後、外側から内側に向かって切断し、横隔膜を下の肋骨から剥離します。次に、鎌状靭帯を指標として、横隔膜の反対側で心膜がどこに付着しているかを確認します。肋骨ケージの片側を慎重に持ち上げて胸腔と心臓を露出し、心膜穿刺を行い、HBSSと細胞を吸引した後、再度挿入します。シリンジの操作はこの手順の中で最も困難な部分です。心膜をわずかに切り裂いてしまっても、慌てないでください。心膜が心臓の周囲を十分に囲み、心臓を包むボウルのような形状を維持できていれば、心臓上の洗浄操作は引き続き可能です。胸骨と心臓の中間あたり、なるべく尾側よりも頭側の心膜上の点を選択し、クイックキャスのテフロンチップを心膜の2層分貫通するように押し込みます。チップが適切に配置されたら、2〜3 mLのHBSSを心膜腔にゆっくりと注入します。心膜腔が満たされたら、チップを空の10 ccシリンジに切り替え、チップを再び心膜腔に戻します。同じ穿刺孔を使用して、吸引時にチップが心膜嚢の壁、特に心臓の下面に近づきすぎないように注意しながら、可能な限り多くの緩衝液を吸引します。次に、抽出した液体を15 milliliterチューブに移します。チューブを4 °Cに保ったまま、心膜嚢に2～3 milliliterのHBSSをさらに満たし、その後排出します。回収したHBSSを15 mLチューブに移す操作を、さらに3〜4回繰り返します。各洗浄後、心臓、肺、または他の研究に必要な組織を取り出します。その間、チューブは氷上に保持してください。使用しない場合は、回収した免疫細胞サンプルを200 ×gで10分間遠心分離します。4 °Cで上清を除去し、1 mLのHBSSでペレットを再懸濁します。心臓免疫細胞の単離後における細胞形態および成熟度を判定するための組織学的研究の例を以下に示します。左側と右側に、それぞれ toluidine blue、AUM blue、および seranin O で染色した心臓マスト細胞を提示します。ここでは、心臓の心外膜領域から単離した心臓マスト細胞を既知の活性化剤で刺激した機能研究の結果を示します。単離した心臓マスト細胞は、10 µg/mL のコンパウンド 48/80 または 10 µM のサブスタンス P で処理することで、ヒスタミンを放出する能力を維持しています。次の 2 つの図では、単離した心臓免疫細胞のフローサイトメトリー分析による代表的な散布図を示しています。最初の散布図では、心膜単離物中に CD4 陽性 T 細胞が同定されています。2 番目の散布図では、CD8 陽性 T 細胞が検出されています。この手順を行う際は、緩衝液を注入し、免疫細胞を含む緩衝液を吸引する際に、心膜の完全性を保護することが重要です。これにより、得られる細胞の回収率を高めることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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私たちは、基礎研究と生物学と治療の可能性の研究のために、マウス心膜を分離し、精製するためのプロトコルを最適化しました。...

マウス心ペリサイトの単離と精製

ここで提示するプロトコルは、酵素消化を介して単一細胞懸濁液を調製することにより、マクロファージおよび他の非免疫細胞の様々なサブセットをヒトおよびマウスの心筋から単離するプロトコルである。単離されたマクロファージのフローサイトメトリーベースの同定および特性評価のためのゲーティングスキームも提示される。...

ヒトおよびマウスの心筋標本からのマクロファージサブセットおよび間質細胞の分離

本研究の目的は、心筋細胞を成体から再現的に単離し、DNAの含有量と核形成を測定する方法を開発することです。...

免疫細胞化学とプロイド分析のための固定心からの心筋細胞の分離

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

ここで紹介するプロトコルは、マウス心臓の洞房結節(SAN)および房室結節(AVN)領域から心臓常在マクロファージを単離するための段階的なアプローチを提供します。...

マウス洞房・房室結節からの常在型心臓マクロファージの単離と培養

ここでは、フローサイトメトリーを用いた血管内または内皮腔内の位置に基づく心筋Bリンパ球の定量と分化のためのプロトコルを報告します。...

フローサイトメトリーによる心筋B細胞の定量および分析(英語)

学ぶ心臓免疫細胞の単離法。ラット心膜腔からHBSS灌流・吸引で機能的免疫細胞を収集し、コラゲナーゼ消化による活性化を回避。フローサイトメトリーなどの解析に適した細胞を得られる。

機能心臓の免疫細胞の単離

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