機能心臓の免疫細胞の単離
December 5th, 2011
心臓から機能的な免疫細胞を単離するためのこの方法では、これらの細胞の反応性の低下、その結果、不要な免疫細胞の活性化を引き起こすコラゲナーゼ消化、の従来の方法に代わる方法が用意されています。分離の手法は、酵素消化に関連する問題を回避することによって機能的な心臓の免疫細胞が得られます。
この手順の全体的な目的は、機能的な心臓免疫細胞を分離することです。これは、最初にラットを換気し、心臓を囲む心嚢を露出させることによって達成されます。次に、ハンクのバランス塩溶液またはHBSSを心膜腔に注入します。
次に、HBSSが吸引され、心膜腔からの免疫細胞が含まれるようになりました。最後に、単離手順から得られた免疫細胞の数が説明されました。最終的には、化学的脱顆粒または共培養実験、フローサイトメトリー、免疫蛍光分析、または細胞の薬理学的処理を実施して、心免疫細胞の機能および生物学的活性を評価することができる。
私の研究室からは3名がこの手続きのデモンストレーションを行います。大学院生のジェニファー・マクラーティ、ポスドク研究員のジゼル・メレンデス、そして私の主任技術者であるウィル・スペンサーです。この技術の主な利点は、コラーゲン消化などの既存の免疫細胞単離方法よりも優れている点であり、望ましくない免疫細胞の活性化と損傷を防ぎ、実験的治療に対する免疫細胞の応答性を維持します。 始める前に、まな板を30度の角度に傾けます。
次に、ドレンメル電動工具を使用して、18ゲージのベベルニードルの端の半分から4分の3を切り取ります。ラットが監視されたら、気管内チューブを使用して先端を短くします。適切な麻酔を確保するために、動物の腹部、胸部、喉を剃り、腹部の中央部からあごの下まで皮膚を切開します。
次に、首の前三角形の筋肉を解剖して、露出した気管を露出させ、その下に3つのゼロブラック編組縫合糸を配置します。次に、軟骨リングの間の気管を切開し、気管チューブを挿入します。3つのゼロ縫合糸を気管の周りにしっかりと結び、気管チューブを固定します。
次に、気管内チューブを小動物の人工呼吸器に接続し、呼吸を誘発します。心臓と肺の適切な酸素供給を確保するために、人工呼吸器の吸気と呼気中にラットで胸部が均等に上下することを確認します。免疫細胞の単離を開始する前に、10 ccのシリンジにHBSSを充填します。
次に、針の上で24ゲージのバクスター血管内テフロン先端の半分から4分の3を切り取ります。アイソレーション手順のための短い先端を作るためのクイックキャス。24ゲージのバクスター血管内を針の上に置きます。.
HBSSを含むシリンジのクイックカテーテルチップ。次に、HBSS充填シリンジ、すべてのバッファー、空の50ミリリットルの円錐管を氷の上に置きます。次に、線状アルバから剣状突起まで腹壁に正中線切開を行います。
次に、剣状突起のすぐ外側から始めて、胸郭を通して両側を切開します。肺、心臓、心膜を裂かないように注意しながら、腋窩に向かって斜めに続けます。次に、横方向から内側に切断する下部肋骨からダイヤフラムを解剖します。
次に、鎌状靭帯をランドマークとして使用し、横隔膜の反対側に心膜が取り付けられている場所を示します。胸郭の片側をそっと持ち上げて、胸腔と心臓を露出させます。心膜穿刺は、HBSSと細胞を吸引し、再挿入します。
シリンジは、手順の最も難しい部分です。心膜をわずかに裂けても、慌てないでください。心膜が心臓を十分に取り囲み、その周りにボウルを形成する限り、心臓を洗うことができます。
胸骨と心臓のほぼ中間にある心膜上の点、できれば脊髄よりも吻側を選択し、クイックキャスのテフロン先端を心膜の両方の層に押し込みます。先端が所定の位置に配置されたら、心膜腔を2〜3ミリリットルのHBSSで静かに満たします。袋がいっぱいになったら、チップを空の10ccシリンジに交換し、チップを心膜腔に戻します。.
同じ入口穴を使用して、特に心臓の下側で吸引を提供しながら、先端が心膜嚢の壁に近づきすぎないように、できるだけ多くのバッファーを吸引します。次に、流体抽出時にバッファーを15ミリリットルのチューブに移します。チューブを摂氏4度に保つと、心膜嚢にさらに2〜3ミリリットルのHBSSが充填され、空になります。
回収したHBSSを15ミリリットルのチューブに移すのに、さらに約3〜4回。毎回の洗浄後、心臓、肺、または他の研究に必要なその他の組織を取り除きます。チューブを氷の上に保ちます。
使用しないときは、採取した免疫細胞サンプルを重力200倍で10分間遠心分離します。4 SIUで、サピネートを取り出し、ペレットを再構成します。HBSSの1ミリリットルで示されています。
ここでは、心免疫細胞単離後の細胞の形態と成熟度を決定するための組織学的研究の例を紹介します。トインブルーとAUMブルーとセラニンOで染色された心筋肥満細胞がそれぞれ左側と右側に提示されています。ここでは、心臓の心外膜領域から単離された心臓肥満細胞を既知の活性化因子で刺激した機能研究の結果を示します。
単離された心臓肥満細胞は、ヒスタミンを放出する能力を維持し、化合物48、80または物質の10マイクロモル/ミリリットルあたり10マイクログラムで治療され、次の2つの図 P.In、単離された心臓免疫細胞のフローサイトメトリー分析からの代表的な散布図は、最初の散布図CDに示されている4つの陽性T細胞が心膜分離株で同定されている。2 番目の散布図では、8 つの陽性 T 細胞が検出されます。この手順を試みるときは、緩衝液を注入するときに心膜の完全性を保護することを覚えておくことが重要であり、免疫細胞を含む緩衝液を吸引するときには、得られる細胞の収量が増加します。
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概要
心臓から機能的な免疫細胞を分離するこの方法は、免疫細胞を活性化させ、応答性を低下させる可能性のある従来のコラーゲナーゼ消化法に代わるものを提供します。この手順は、酵素消化に関連する問題を避けながら、機能的な心臓免疫細胞を生成します。
主要な研究要素
科学分野
- 心臓免疫学
- 細胞分離技術
- 機能細胞分析
背景
- 従来の方法は、望ましくない免疫細胞の活性化につながる可能性があります。
- 機能的な免疫細胞は心臓反応を理解するために重要です。
- 改良された分離技術は実験結果を向上させる可能性があります。
- 免疫細胞の機能性理解は心臓健康研究にとって重要です。
研究目的
- 機能的な心臓免疫細胞を効果的に分離すること。
- 分離中に免疫細胞の活性化を最小限に抑えること。
- 心臓免疫細胞機能のさらなる分析を容易にすること。
使用した方法
- ラットの換気と心膜嚢の露出。
- 心膜腔へのHank's balance salt solution（HBSS）の注入。
- 免疫細胞を集めるためのHBSSの吸引。
- 様々なアッセイを通じた分離された免疫細胞の評価。
主要な結果
- 心膜腔からの免疫細胞の成功的な分離。
- 分離後に機能分析を行うことができます。
- 従来の方法と比較して免疫細胞の活性化が減少しています。
- 心臓免疫反応に関するさらなる研究の可能性。
結論
- 新しい分離方法は免疫細胞の機能性を保持します。
- 酵素消化の欠点を回避します。
- 後続の実験分析の信頼性を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating functional cardiac immune cells without activation addresses a key challenge in cardiac immunology research, where traditional enzymatic methods compromise cell responsiveness. This technique enables reliable downstream functional assays, supporting target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery. By preserving immune cell functionality, it improves predictive confidence in preclinical models of cardiac disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac immune cell function in pathological remodeling without activation artifacts.
- Operational Value: Provides a reproducible source of immune cells for hypothesis testing in target validation workflows.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields immune cells suitable for functional readouts such as degranulation and cytokine release assays.
- Operational Value: Supports assay standardization by providing consistent, non-activated immune cell preparations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates co-culture experiments with cardiac fibroblasts to model extracellular matrix modulation relevant to fibrosis.
- Operational Value: Allows phenotypic and maturity characterization of isolated immune cells for translational biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical modeling, enabling functional immune cell analysis at multiple stages of cardiovascular research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell contributions to cardiac pathology via preserved functionality.
- Screening: Enables quantitative assessment of immune cell responses to pharmacological modulators.
- Analytics: Generates viable cells for flow cytometry, immunofluorescent analysis, and functional degranulation assays.
- Translational Research: Connects immune cell isolation to preclinical continuity through co-culture with cardiac fibroblasts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for cardiac immunology studies across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduction of mechanistic ambiguity in immune cell-mediated cardiac remodeling.
- Operational Value: Standardized isolation protocol improves reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing false negatives from activated or dysfunctional immune cells.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reliable immune cell functional data.
Implementation Considerations
- Requires anatomical knowledge of rat xiphoid process, axilla, falciform ligament, and pericardium.
- Necessitates microdissection skills and ventilator setup for animal preparation.
- Depends on sterile HBSS preparation and temperature control (4°C) during sample handling.
- Demands precision in pericardial puncture and aspiration to maintain sac integrity and cell yield.
- Limited to small animal models; adaptation to larger species would require procedural scaling.
