細菌性角膜炎のブタex vivo角膜モデル:角膜上皮細胞における細菌感染を確立する技術

脊椎動物の目では、最も外側の保護カバーである角膜が緑膿菌に感染し、角膜の炎症状態である角膜炎を引き起こします。

ex vivo 角膜角膜炎モデルを確立するには、ブタの目の角膜強膜ボタンをペトリ皿に入れます。この組織セグメントは、強膜の残骸に囲まれた角膜、つまり線維状の眼を覆うもので構成されています。ペトリ皿に抗生物質を含む培地を補充して、角膜上皮表面から汚染微生物を除去します。

角膜の中央部分を見つけます。最も外側の角膜上皮層を突き刺す目的のパターンで表面の水平および垂直の切開を行います。切開した組織を角膜側を下にして、特殊な中空型に移します。

角膜腔を液化寒天で満たし、固化させ、型内の組織を拘束します。型を反転させて、角膜上皮の傷ついた表面を露出させます。シュードモナス懸濁液を角膜の切開領域にピペットで入れます。最適な細菌増殖のために、より多くの増殖培地を型に重ねます。培養皿に培地を補充し、インキュベートします。

細菌は上皮切開部を横切って間質に侵入します。間質内では、細菌が角膜内の免疫細胞、タンパク質、体液の浸潤を引き起こし、炎症反応を引き起こします。体液の蓄積により角膜の混濁が増加し、細菌性角膜炎が確認されます。

ペトリ皿から培地を取り出し、角膜を1ミリリットルの滅菌PBSで2回すすいでください。鉗子で角膜を持ち、軽く絞ります。10Aメスを使用して、角膜強膜ボタンの中央部分に4つの切り込み(垂直2つ、水平2つ)を上皮層を通って下にある間質に切り込みを入れます。

滅菌ガラス型を幅の広い部分を上にして6ウェルプレートに入れます。次に、角膜をガラス型の中央に置き、上皮側を下に向けて角膜の損傷部分をガラス型の中心に置きます。

1ミリリットルの寒天溶液を加えて、ガラス型を完全に満たします。寒天を固めた後、角膜上皮が上を向くようにガラス型を反転させます。

ガラス型は、接種物や薬液の漏れを防ぐために、寒天で縁まで密閉する必要があります。

200マイクロリットルの細菌培養物をカットエリアに直接ピペットで入れます。また、実験ごとに、細菌培養物を追加する代わりに、1つの角膜に200マイクロリットルの滅菌PBSを追加してコントロールを設定します。

次に、各角膜の上部に185マイクロリットルのPBSを加えて、上皮を湿らせます。次に、抗生物質を含まない1ミリリットルのDMEMを各ウェルの底に加えます。6ウェルプレートを摂氏37度で湿度と5%の二酸化炭素で最大24時間インキュベートします。

6ウェルプレートからDMEMを廃棄し、各ウェルに1ミリリットルの滅菌PBSを加えてすすぎます。角膜強膜ボタンの中央部分に触れずに、PBSをそっと取り外します。滅菌鉗子を使用してガラス型を取り外し、5%Distelに入れます。角膜強膜ボタンの上部を1ミリリットルのPBSで2回優しくすすぎます。