使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル
2011年9月29日
ここでは、エージング中規制またはゲノムDNAの不安定性に寄与する遺伝子/経路を研究するために酵母の時系列の寿命モデルと組み合わせることができるDNAの突然変異試験のセットを説明します。
この手順の全体的な目標は、年代順の寿命と一連の単純なDNA損傷および突然変異アッセイを組み合わせることにより、酵母の年齢依存性ゲノム不安定性を研究することです。これは、まず2日ごとに年代順の老化培養物をサンプリングし、コロニー形成単位またはCFU形成によって生存率を確認することによって達成されます。次のステップは、老化培養物をサンプリングし、突然変異特異的な選択培地に細胞をプレーティングすることにより、DNA変異を調べることです。
最終的には、突然変異アッセイの結果を生存率に正規化することにより、酵母の経時的老化中にDNA変異の変化を示す結果を得ることができます。この方法は、老化とゲノムの不安定性を関連付けるメカニズムなど、老化分野での重要な質問に答えるのに役立ちます アリアの老化とゲノムの不安定性をアッセイするには、酵母の年代順の寿命またはCLSを最初に1ミリリットルの合成全グルコースに接種し、SDC培地に1つの酵母コロニーを接種し、翌日に摂氏30度で振とうしながら一晩インキュベートします。一晩の培養物を10ミリリットルの新鮮なSDC培地に希釈し、OD 600を0.05〜0.1にして、摂氏30度で3日間振とうします。
3日目に、細胞が固定相にあるとき、オートクレーブ水で各Eloquaを10,000倍希釈し、次にフラスコから2つの10マイクロリットルのアリコートを取り出し、A-Y-E-P-Dプレート上の各希釈培養物の10マイクロリットルをプレートします。コロニーが発生するまでプレートを摂氏30度でインキュベートします。3日目から発生するコロニーの数またはコロニー形成単位は、100%生存と見なされます。
その後の数日間で、めっきのために老化培養物からアリコートを除去し続けます。それに応じて希釈係数を調整して、CFUアッセイで約20〜100コロニーを確保します。培養物の生存率が通常11日目から13日目の間に1%未満に低下したとき、サンプリングは停止され、細胞生存率はプレート上で老化した細胞でも研究することができます。
このアッセイを開始するには、1つのコロニーを1ミリリットルの合成完全グルコース培地に接種し、摂氏30度で振とうしながら一晩インキュベートします。培養液が1ミリリットルあたり約10〜8細胞に成長したら、オートクレーブ水で培養液を10マイクロリットルあたり100〜200細胞、10マイクロリットルあたり1000細胞に希釈します。各株について、めっき密度に応じてラベル付けされた8〜20枚のトリトファンドロップアウトSDCプレートのセットを調製します。
老化中の生存率の低下を見越して10〜100コロニーを数えることができるように、プレートには、各プレートに10〜30マイクロリットルの希釈培養物の2アリコートを充填します。プレートを摂氏30度に設定したプレートを、プレーティング当日の寿命分析期間中インキュベートし、その後2日ごとに1つのプレートを取り外し、0.5ミリリットルのトリトファンを滴下して生細胞を増殖させます。プレートを摂氏30度でさらに48〜72時間インキュベー
トします。48〜72時間後。トリプトファン版の日の生存率についてCFUを数え、時系列の老化中の4つのDNA損傷と突然変異頻度をアッセイします。特別な特徴を持つ多くの奇妙なものは、酵母CLSアッセイ用の野生型株と並行して成長しています。
自然突然変異の頻度は、経年的に老化した培養物におけるカンナバンニング抵抗性の頻度を測定することで評価できます。血漿アルギニンpermeaseレンダリング細胞をコードする缶1遺伝子の突然変異は、アルギニン類似体Lカナバンカナバン耐性細胞に耐性細胞は、アルギニンドロップアウト合成完全な媒体プレートで成長し、Lカナバン硫酸塩で補完され、トリップの琥珀色の突然変異を含む株のトリップポジティブ復帰周波数の測定。1つのコーティングシーケンスにより、酵母の年代順老化旅行中の塩基置換率を推定できます。
陽性復帰細胞は、トリプトファンドロップアウトプレート上で増殖します。リゼ陰性株EH one 50は、オープンリーディングフレームにプラス4シフトを秘めており、その結果、リジンのox萎縮が起こり、これは小さな挿入または欠失の突然変異によって元に戻すことができます。復帰体は、肉眼的染色体再配列または GCR を検出するためにリジンドロップアウトプレート上で選択されます。
変異株は、HX T 13が染色体5上の7.5キロベースのテロメアから缶1に位置し、Uによって破壊され、缶1とUの両方の3つのカセット変異により、それぞれLカナバンと5つのフルオロオロ酸に耐性のある細胞になります。両方の遺伝子で発生する点突然変異の頻度は低いため、エルカナバンと5つのフルオロオロティック酸の両方に対する耐性の頻度の分析は、相同および相同組換えのレベルを監視するためのgcrの推定を提供します。年代順の老化中に、100%相同逆反復または91%相同のいずれかを持つ突然変異体が生成されます。
IRSの彼の3つの遺伝子座の組み換えでIRSは、機能的な彼の3つのタンパク質の発現を可能にします。したがって、組換えが起こった細胞は、ガラクトースを添加したヒスチジンドロップアウトプレート上で増殖します。3日目に、細胞が固定相にあるとき、適切な量の細胞が各老化培養物から除去されます。
すべてのアッセイで同じ手順が使用されるため、1つのサンプルのみが処理されます。このビデオでは、卓上型遠心分離機で回転させて細胞をペレット化します。上清を除去し、細胞を1ミリリットルのオートクレーブ水ペレットに再懸濁します。
再度、上清を除去し、細胞ペレットを適切なプレート上の100マイクロリットルの水プレートセルに再懸濁して、目的の元に戻すために選択します。3〜4日後に摂氏30度でプレートをインキュベートし、CFUをカウントすると、突然変異の頻度は生細胞の数に正規化されます。このグラフは、野生型細胞の年代生存率をS CH、9デルタ、TOR1デルタ、およびRA2デルタ変異体と比較した場合の典型的な年代順寿命アッセイの代表的な結果を示しています。
液体培養では、TOR1、CH9、またはRA2を欠く変異体は、経時的に長い寿命を示します。さらに、CH9とRA2の欠損は、さまざまな炭素源の存在下での長寿促進の年代順生存に相加的な影響を及ぼします。NCを使用した場合、2つの生存率アッセイを次のグラフに示します。
1日目、SDC野生型培養物を希釈し、炭素源を含まないSCトリップドロップアウトプレートに播種しました。グルコースエタノールまたはグリセロールオレートプレートを添加したSC Trippドロップアウトプレートを、2日ごとに摂氏30度でインキュベートしました。各セットから1枚のプレートを取り出し、成長とコロニー形成を可能にするために適切な栄養素を添加しました。
年齢依存の突然変異頻度は、株、背景、遺伝子操作、培養、状態、年齢によって大きく異なります。この表は、野生型株で得られた典型的な結果を示しています。トランス病変合成の代表的な結果を次の画像に示します。
年齢依存的な突然変異頻度の増加は、核抽出物やさまざまなDNAテンプレートを使用した誤ったDNA修復の変化を伴う可能性があります。年代順に老化した細胞における翻訳合成またはTLSを評価できます。3日齢の固定期、野生型、およびSCHナインデルタ変異体細胞からの核抽出物を分析しました。
テンプレートが破損していない TLS 製品は実線で示され、テンプレートが損傷している TLS 製品は点線で示されます。長命の s CH 9 デルタ変異体フリープライマーからの核抽出物では、トランス病変合成は観察されませんでした。このビデオを見れば、酵母の年代順の寿命とDNA変異解析の方法について十分に理解できるはずです。
概要
この記事では、年代別寿命分析とDNA変異アッセイを組み合わせることで、酵母の年齢依存性ゲノム不安定性を研究する方法について説明しています。このアプローチにより、研究者は老化に伴うゲノムDNA不安定性に関与する遺伝子と経路を調査することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- ゲノミクス
- 老化
- 酵母生物学
背景
- ゲノム不安定性は老化の特徴です。
- 酵母は老化プロセスを研究するためのモデル生物として機能します。
- DNA変異の理解は老化メカニズムへの洞察を提供できます。
- 以前の研究では、ゲノム不安定性と様々な老化関連経路との関連が示されています。
研究の目的
- 酵母における老化とゲノム不安定性の関係を評価すること。
- この目的のためのDNA変異アッセイのセットを開発すること。
- 変異頻度の結果を細胞生存率に正規化すること。
使用された方法
- 2日ごとに年代別老化培養物をサンプリングすること。
- コロニー形成単位（CFU）形成を通じて生存率を評価すること。
- 変異特異的選択培地に細胞をプラッティングすること。
- 自然発生性変異頻度と染色体再編成を測定すること。
主な結果
- 年代別老化の間にDNA変異の変化が観察されました。
- 老化に関連する特定の変異が特定されました。
- 結果はゲノム不安定性と寿命の間に相関があることを示しました。
- 異なる酵母株が異なる変異頻度を示しました。
結論
- 開発されたアッセイは老化におけるゲノム不安定性を研究するのに効果的です。
- 結果は老化とゲノム不安定性を結びつけるメカニズムの理解に貢献します。
- このアプローチは老化分野でのさらなる研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to mechanistically de-risk aging-related targets by linking genomic instability to lifespan phenotypes in a genetically tractable system. It supports predictive confidence in target validation by quantifying age-dependent DNA damage outputs that correlate with mammalian carcinogenesis pathways. The yeast chronological lifespan model provides a scalable, reproducible platform for early discovery screening of compounds or genetic modifiers affecting genome maintenance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses linking aging pathways to DNA mutation accumulation and chromosomal instability.
- Operational Value: Functionally validate targets involved in DNA repair, recombination, and lesion synthesis using yeast genetic models.
- Scientific Value: Support predictive confidence by measuring base substitutions, frameshifts, GCRs, and recombination as quantitative biomarkers of genomic integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated biological systems for downstream compound screening by establishing age-stratified yeast cultures with known mutation profiles.
- Operational Value: Enable assay standardization and reproducibility through CFU-normalized mutation frequency readouts across aging timepoints.
- Operational Value: Support screening readiness and platform reuse via simple selection media (canavanine, 5-FOA, tryptophan, lysine, histidine) compatible with high-throughput plating.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Align yeast genomic instability readouts with disease-relevant systems by modeling conserved mechanisms of translesion synthesis and homologous recombination.
- Operational Value: Ensure translational continuity from discovery through preclinical validation by tracking mutation frequency changes that parallel mammalian aging phenotypes.
- Scientific Value: Facilitate risk-adjusted advancement decisions by identifying genetic modifiers that suppress age-dependent mutagenesis and extend chronological lifespan.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification by providing mechanistic insights into genome maintenance pathways that influence cellular longevity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of aging-related genes (e.g., TOR, Sch9, Ras2) in modulating DNA damage accumulation and repair fidelity.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via mutation-specific plating and viability normalization for compound or strain comparison.
- Analytics: Enables comparative analysis of DNA repair activity through nuclear extract-based translesion synthesis assays using defined DNA templates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling conserved genomic instability mechanisms observed in mammalian aging and cancer.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal study of genetic or pharmacological interventions on genome stability across the aging timeline.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic de-risking of genomic instability contributors to aging phenotypes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of mutation frequency measurements normalized to viable cell counts.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by linking target modulation to reduced mutagenesis and extended lifespan in a conserved model system.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of aging-related targets based on their impact on DNA maintenance pathways and genomic fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, chronological lifespan maintenance, and mutation assay design.
- Dependent on incubation infrastructure for 30°C shaking cultures and plate-based selection assays.
- Necessitates cross-team standardization of dilution factors, plating densities, and viability normalization protocols.
- Involves adaptation considerations when translating yeast-specific readouts (e.g., canavanine resistance) to mammalian surrogate endpoints.
- Practical limitations include extended assay duration (11–13 days) and reliance on genetic markers for specific mutation types.
