Name: 使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぼう、出芽酵母を用いた年齢依存性ゲノム不安定性の研究手法。時系列寿命解析とDNA変異アッセイを組み合わせ、老化における遺伝子機能とゲノム安定性のメカニズムを解明する方法です。

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我々は、プラスミド、酵母菌株を提供するためのS.ジンクスロバートソンとE ·ハイデンリッヒに感謝、P. PhamさんとMFグッドマンヘルプwiththe TLSアッセイのために。この作品は、エイジング総合研究助成のためのアメリカ連合によっておよびNIH AG20642、AG025135によって、部分的に、サポートされていました。

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<li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li>
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<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner%2FBloom+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

液体老化の文化はいつか再生/ CLS分析を複雑にあえぎ表現型13を 、示す。人口以上の90から99パーセントが生存能力を失ったときに再生が一般的に発生します。この表現型は、多くの場合、酸化ストレスおよび/または細胞の減少の保護に関連付けられています。例えば、この表現型の頻度は、より多くの細胞質スーパーオキシドジスムターゼを欠く細胞で2倍以上と大幅に長寿命変異体で減少します（例えば、sch9ΔまたはRAS2Δ）または変異体を過剰発現してスーパーオキシドは、22ジスムターゼ。実際には、我々は、経時的老化時の高死亡率の段階で3つの連続した​​サンプル用実行可能性の実現可能性または安定化の増加として再成長を定義する。 異なるDNAの変異の年齢に依存する周波数が大幅にひずみ背景、遺伝子操作、培養条件、ならびに再生/あえぎと非常に低い生存率に応じて異なります。プレ実験はこのようなperformingtheフルスケールの寿命解析の前に変異の周波数範囲を決定するために突然変異試験のための様々な播種密度と平均値と最大生存などの時点で行ってください。野生型の菌株は、常に、任意の治療や遺伝的変異体と平行に寿命や突然変異の頻度の研究に含まれるべきである間実験-ばらつきが考慮できるように。複数の生物学的なレプリカが研究に含まれるべき、と、液体の両方とその場可能性/突然変異アッセイの結果を裏付けるために実施すべきである。 代わりに組み合わせて複数のアッセイを用いて年齢依存性ゲノム不安定性のプロファイリング、DNAの突然変異の特定のタイプに焦点を当ててから、年齢依存性のゲノム不安定性に寄与する特定のDNA損傷とDNA損傷修復システム（秒）に光を当てることができる。例えば、他のDNAの突然変異のものに比べて総染色体再配列（GCRs）の有意な増加が、、elevationof二重鎖切断および/または酵母中の接合端（NHEJ）非相同の減損を示唆する野生型酵母で観察される経時的老化（表2）。野生型エージング酵母で得られたCAN1突然変異のスペクトルは、（CAN1遺伝子の塩基配列決定）経時的老化とエラーが発生しやすいDNAの修復中に酸化的損傷の増加を示唆し、一方、長寿命のsch9Δ変異体では、以下の酸化的DNA損傷と程度に下げてエラーを起こしやすいtranslesionの合成は、20を観察した。 ここで説明する方法は、さらに年齢依存性のゲノム不安定性を研究するために費やさすることができます。例えば、静止及び非静止期の細胞は、Allenらによって記述された密度勾配法を用いて酵母固定相培養細胞から分離することができます。23。ここで説明する変異のアッセイと組み合わせることで、我々は、年齢依存性の変異の大部分は静止細胞ではなく、分割し、損傷やアポトーシス細胞20,24から生じることが報告されている。

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して s.出芽酵母時系列寿命モデル

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Saccharomyces cerevisiaeの老化モデルを用いた研究は、部分的に高等真核生物1-2に保存されている寿命調節経路を明らかにしました。酵母老化モデルのシンプルさとパワーは、DNA損傷とゲノム維持だけでなく、老化の間に病気への貢献を研究するために調べることができます。ここで、我々は単純なDNAで酵母の時系列の寿命を組み合わせることにより、塩基置換、フレームシフト変異、総染色体再配列、および相同/ homeologous組換えだけでなく、核DNA修復活性を含め、年齢依存性のDNA変異を研究するためにシステムを説明損傷と突然変異試験。ここで説明する方法は、ゲノムの不安定性と哺乳類では年齢依存性DNAの変異と癌の根底にあるメカニズムを制御する遺伝子/経路の同定を容易にしてください。

ここでは、エージング中規制またはゲノムDNAの不安定性に寄与する遺伝子/経路を研究するために酵母の時系列の寿命モデルと組み合わせることができるDNAの突然変異試験のセットを説明します。

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

Saccharomyces cerevisiaeの加齢モデルを用いた研究により、高等真核生物においても部分的に保存されている寿命調節経路が明らかになっています1-2。...

この手順の全体的な目的は、時間的寿命と一連の簡便なDNA損傷および変異アッセイを組み合わせることで、酵母における加齢依存的なゲノム不安定性を研究することです。これは、まず2日ごとに時間的加齢培養物をサンプリングし、コロニー形成単位（CFU）形成による生存率を確認することで達成されます。手順の次のステップでは、加齢培養物をサンプリングし、変異特異的な選択培地に細胞を播種してDNA変異を検査します。最終的に、変異アッセイの結果を生存率で標準化することにより、酵母の時間的加齢におけるDNA変異の変化を示す結果を得ることができます。この手法は、加齢とゲノム不安定性を結びつけるメカニズムなど、加齢研究分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。酵母の時間的寿命（CLS）を測定するには、まず、単一の酵母コロニーを1 mLの合成完全グルコース培地（SDC培地）に接種し、30 °Cで振盪しながら一晩培養します。翌日、一晩培養した培養液を新鮮なSDC培地10 mLに希釈し、OD 600を0.05から0.1に調整した後、30 °Cで振盪しながら3日間培養します。3日目に、細胞が定常期にあるとき、各Eloquaをオートクレーブ滅菌水で10,000倍に希釈し、次にフラスコから10 µLずつ2つの分注量を取り出し、希釈した各培養液10 µLをA-Y-E-P-Dプレートに塗布します。コロニーが出現するまで、プレートを30 °Cでインキュベートします。3日目の培養液から出現したコロニー数またはコロニー形成単位を、生存率100%と見なします。以降の日々も、プレート播種のために老化培養液から分注を継続します。CFUアッセイにおいて約20〜100個のコロニーが得られるよう、希釈倍率を適宜調整してください。培養液の生存率が1%未満に低下した時点でサンプリングを終了します。これは通常11日目から13日目の間になります。また、プレート上で老化させた細胞を用いて生存率を検討することも可能です。このアッセイを開始するには、単一のコロニーを1 mLの合成完全グルコース培地に接種し、30 °Cで振盪させながら一晩インキュベートします。培養液が約10⁸ cells/mLまで増殖したら、オートクレーブ滅菌水を用いて、10 µLあたり100～200 cellsおよび1000 cellsになるように培養液を希釈します。各株について、播種密度に従ってラベルを貼ったトリプトファン欠損SDCプレートを8～20枚用意します。老化に伴う生存率の低下を想定し、10〜100個のコロニーを計数できるように、希釈した培養液を10〜30 µLずつ2回、各プレートに分注します。プレートセットを30 °Cでインキュベートします。寿命解析期間中、プレート播種当日およびその後2日ごとに1枚のプレートを取り出し、生存細胞を増殖させるため、トリプトファン0.5 mLを滴下します。その後、プレートを30 °Cでさらに48〜72時間インキュベートします。48～72時間後、トリプトファン添加日の生存率をCFUで測定し、時間的老化におけるDNA損傷と突然変異頻度を分析します。酵母のCLSアッセイでは、野生型株と並行して、特殊な性質を持つ複数の変異株を培養します。自然突然変異頻度は、経時的に老化させた培養液におけるカナバニン耐性の頻度を測定することで評価できます。形質膜アルギニンパーメアーゼをコードするCAN1遺伝子の変異により、細胞はアルギニンアナログであるL-カナバニンに対して耐性を持ちます。カナバニン耐性細胞は、L-カナバニン硫酸塩を添加したアルギニン欠損合成完全培地プレート上で増殖します。TRP1コーディング配列にアンバー変異を持つ株におけるtrp⁺復帰頻度の測定により、酵母の経時的な老化過程における塩基置換率を推定することが可能です。陽性復帰細胞はトリプトファン欠損プレート上で増殖します。lyse陰性株EH1-50は、オープンリーディングフレームに+4シフトを有しており、その結果リシン欠損となりますが、これは小さな挿入または欠失変異によって復帰させることができます。粗大な染色体再編成（gcr）を検出するため、復帰変異体はリシン欠損プレート上で選別されます。染色体5のcan1からテロメア側へ7.5 kbの位置にあるHX T 13がU3カセットによって破壊された変異株を使用します。can1およびU3の両遺伝子の変異により、細胞はそれぞれL-Canavanおよび5-フルオロオロト酸に対して耐性を持ちます。両方の遺伝子に点突然変異が起こる頻度は低いため、L-Canavanと5-フルオロオロト酸の両方への耐性頻度を解析することで、相同組換えおよび非相同組換えのレベルをモニターするためのgcrの推定が可能になります。時間的老化の過程で、100%相同な反転反復配列または91%相同な反転反復配列を持つ変異体が生成されます。IRSのhis3遺伝子座における組換えにより、機能的なhis3タンパク質が発現します。したがって、組換えが起こった細胞は、ガラクトースを添加したヒスチジン欠損プレート上で増殖します。3日目、細胞が静止期に達した時点で、各老化培養液から適切な量の細胞を回収します。すべての分析で同じ手順が用いられるため、ここでは1つのサンプルのみを処理します。このビデオでは、ベンチトップ遠心機で遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、1 mLのオートクレーブ済み水で細胞を再懸濁してください。再び上清を除去し、細胞ペレットを100 µLの水で再懸濁させ、目的の復帰変異体を選別するために適切なプレートに細胞を播種します。プレートを30 °Cでインキュベートし、3〜4日後にCFUをカウントします。変異頻度は生存細胞数で標準化されます。このグラフは、野生型細胞の生存期間を、S CH nine delta TOR one deltaおよびRAs two delta変異体の生存期間と比較した、典型的な時間経過生存率アッセイの代表的な結果を示しています。液体培養において、TOR1、SCH9、またはRAS2を欠損した変異体は、時間的寿命が延長します。さらに、SCH9とRAS2の両方の欠損は、さまざまな炭素源の存在下で時間的生存における寿命促進に相加的な効果を示します。NC2生存率アッセイを用いた結果を次のグラフに示します。1日目、SDC野生型培養物を希釈し、炭素源を含まないSC trip dropoutプレートに塗布した。グルコース、エタノール、またはグリセロールを添加したSC Trip dropoutプレートを30 °Cで2日ごとにインキュベートした。各セットから1枚のプレートを取り出し、成長およびコロニー形成を可能にするために適切な栄養素を添加した。年齢依存的な変異頻度は、菌株、背景、遺伝子操作、培養条件、および年齢によって大きく異なります。この表は、野生型菌株で得られた典型的な結果を示しています。損傷乗り越え合成（trans lesion synthesis）の代表的な結果は、次の画像に示されています。加齢に伴う変異頻度の増加には、核抽出物とさまざまなDNAテンプレートを用いた誤ったDNA修復の変化が関与している可能性があります。私たちは、時間経過により老化させた細胞における翻訳合成（TLS）を評価することができます。定常期にある3日目の野生型およびSCH9欠損変異体細胞からの核抽出物を解析しました。損傷のない鋳型を持つTLS産物は実線で、損傷のある鋳型を持つTLS産物は点線で示されています。長寿のs CH nine delta変異体の核抽出物では、損傷乗り越え合成は観察されませんでした。フリープライマーは白抜き矢印で示されています。このビデオを視聴することで、酵母における経時的寿命およびDNA変異分析の実施方法について十分に理解できるはずです。

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Biology

生物学

酵母の老化時系列は定常期での時間に関連付けられている細胞の生存率の損失を指します。ここでは、定量的に酵母系列寿命を決定するためのハイスループット法を説明します。...

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

この記事では、酵母の母細胞の複製寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。...

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ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。...

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

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母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するためにサッカロマイセス·セレビシエ

この記事では、マイクロ流体チップの生産と寿命と、単一の酵母細胞の細胞表現型を測定するためのマイクロ流体実験のセットアップのために最適化されたプロトコルを提示します。...

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

ここで述べるレプリカ セットのメソッド、定量的測定線虫の寿命/生存へのアプローチ、healthspan 高スループットかつ堅牢な方法でデータの品質を損なうことがなく多くの条件の審査をできるようにこのプロトコルは、戦略の詳細し、レプリカ セットのデータの解析のためのソフトウェア...

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

ここでは、 サッカロミセスセレビシエの増加したコピー数サプレッサー画面を介して遺伝的相互作用を識別するためのプロトコルです。この方法により、研究者は短命酵母変異体のサプレッサーを同定、クローン化、および試験することができます。オートファジーヌル変異体における SIR2...

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

イメージングプラットフォーム「The Lifespan...

Lifespan Machineを用いたハイスループット行動老化および寿命アッセイ(英語)

我々は、侵襲と偽菌糸分化の尺度としての酵母の付着と寒天の侵略のための定性分析について説明します。この簡単なアッセイは、様々な変異体と同様に酵母の分化への影響、環境手がかりとシグナル伝達経路の侵襲的な表現型を評価するために使用することができます。...

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GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ-...

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

学ぼう、出芽酵母を用いた年齢依存性ゲノム不安定性の研究手法。時系列寿命解析とDNA変異アッセイを組み合わせ、老化における遺伝子機能とゲノム安定性のメカニズムを解明する方法です。

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

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