Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro:特定の遺伝子発現のノックダウンのためのレンチウイルスベースのshRNA発現システムのiHSPCへのデリバリー

死化造血幹細胞および前駆細胞であるiHSPCを、特定のステロイドホルモンと造血サイトカインを含む培地で培養し、未分化状態での細胞増殖を調節することから始めます。適切なカチオン性ポリマーとレンチウイルスベクターを追加します。

換えウイルスは、特定の宿主遺伝子と抗生物質耐性マーカー遺伝子に向けられた短いヘアピンRNA、shRNAのコード配列を持っています。

やウイルスを沈殿させる遠心分離機。インキュベーション中、カチオン性ポリマーは細胞膜電荷を中和し、ウイルスの結合を促進します。膜融合後、ウイルスの遺伝物質と酵素が細胞質に放出されます。ウイルスゲノムは逆転写され、核に移動し、宿主ゲノムに組み込まれます。

コンストラクトにおける特定のプロモーターの影響下で、標的mRNAマッチング配列、ループセグメント、および第1の配列に相補的な別の配列を含むshRNA遺伝子コンストラクトが転写され、不対ヌクレオチドのループセグメントを有するshRNAが形成される。転写後、shRNAは細胞質にエクスポートされます。

特定のリボヌクレアーゼがループセグメントを切断し、二本鎖RNA、siRNAを形成します。siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体、RISCに組み込まれ、siRNA鎖が分離されます。標的mRNAに相補的な保持鎖を持つ活性化された複合体は、配列特異的な方法で標的mRNAを認識して結合し、発現を負に調節し、標的遺伝子抑制を媒介します。

細胞を特定の抗生物質でインキュベートします。安定して形質導入された細胞は抗生物質耐性遺伝子を発現し、それらの選択を可能にします。培地をリフレッシュしてインキュベートすることで、安定して形質導入された細胞の増殖を可能にします。

まず、不死化造血幹細胞および前駆細胞またはiHSPCを、1ミリリットルあたり100ナノグラムのFlt3リガンドと1マイクロモルのベータエストラジオールを添加した完全なRPMI 1640培地に維持します。レンチウイルス形質導入の場合は、1ウェルあたり1 x 10⁵細胞の密度でiHSPCを12ウェルプレートにプレーティングし、Flt3リガンド、ベータエストラジオール、およびポリブレンを含む完全培地1ミリリットルでプレーティングします。

次に、短いヘアピンRNAを運ぶレンチウイルスを各ウェルに100の感染倍数で加えます。次に、プレートを1,100×g、摂氏37度で90分間回転させます。次に、感染した細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、細胞を15ミリリットルのチューブに集めて遠心分離し、培地をFlt3リガンドとベータエストラジオールを含む新鮮な完全培地と交換してポリブレンを除去します。

さらに24時間後、ピューロマイシン1ミリリットルあたり6マイクログラムを培地に加えて、感染した細胞を選択します。選択培地を3日ごとに交換し、細胞を少なくとも1週間維持して、安定して形質導入されたiHSPCを増殖させます。