オールインワンCRISPRゲノム編集:CRISPR-Cas9システムを用いた培養細胞における相同性指向修復ベース遺伝子ノックイン法

まず

、チューブ内に存在する免疫細胞にオールインワンCRISPRプラスミドを追加します。このプラスミドには、宿主ゲノムの標的配列と相補的なsgRNAまたはシングルガイドRNAコード配列と組み合わせたCas9遺伝子が含まれています。

相同性アームまたはHAの間に挟まれた導入遺伝子を含む線形化ドナープラスミドを追加します-相同組換えに必要なDNAリピート。電流を使用してプラスミド混合物を細胞に注入するエレクトロポレーションを実行します。中に入ると、処理されたsgRNAは、発現したCas9ヌクレアーゼと複合体を形成します。

sgRNAは標的部位に結合し、Cas9ヌクレアーゼがプロトスペーサー隣接モチーフまたはPAMとして知られる特定の認識配列を同定し、その近くの宿主DNAを切断できるようにします。これにより、細胞機構がDNAを切除する鈍い端の二本鎖切断が作成され、3フィートのオーバーハングが生成されます。HAの隣接部位の存在は、切断されたDNAがHA配列に結合し、ヘテロ二本鎖構造(Dループ)を形成する相同性指向修復メカニズムを引き起こします。

DNA合成は続き、導入遺伝子配列が元のDNA鎖に再結合するまで相補的な鎖を形成します。Dループの上部は、DNAの欠損部分を合成するためのテンプレートとして機能し、4本のDNA鎖が相互作用する構造である二重ホリデイ接合を生成します。これらの接合部が解消され、ギャップが修復され、標的遺伝子の挿入が促進されます。

各ウェルに抗生物質を含まない500マイクロリットルの完全増殖培地を含む24ウェルプレートを準備します。加湿された37度5%二酸化炭素インキュベーターでプレートを予熱します。エレクトロポレーションシステムの電源を入れます。JURKATまたはRAW細胞の入力エレクトロポレーションパラメータ。

エレクトロポレーション用の細胞-DNA混合物を調製します。JURKAT細胞培養物を25平方センチメートルのフラスコに集めます。細胞を50mL遠心分離管に移します。次に、室温で8分間90 x g で遠心分離して細胞をペレット化します。

上清については、洗浄のために、細胞を5mLのDPBSで再懸濁します。次に、前のステップと同じ条件を使用して、遠心分離によって細胞懸濁液をスピンします。DPBSを除去し、2 mLのDPBSを使用して細胞ペレットを再懸濁します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を使用し、等量の0.2%トリパンブルーと混合します。

細胞数を推定するには、この計数スライドにサンプルをロードします。自動セルカウンターに計数スライドを挿入し、細胞の画像を表示すると、細胞計数結果が得られます。ノックイン実験ごとに、エレクトロポレーションを5回繰り返すために200万個の細胞を計算します。

必要な数の細胞を1.5mL遠心分離管に移します。遠心分離によるペレット細胞。時間を節約するために、遠心分離ステップ中にエレクトロポレーション混合物を調製できます。新しい1.5 mL遠心分離管に、CRISPR-Cas9ベクターのそれぞれ2.5マイクログラム、線形化ターゲティングベクター2.4マイクログラム、および再懸濁バッファーRを総容量55マイクロリットルに加えます。

穏やかに渦を巻き、短時間回転させてよく混ぜます。使用前にエレクトロポレーション混合物を室温に置いてください。回転後、DPBSを吸引し、さらに30秒間遠心分離します。できるだけ多くの上清を取り除きます。調製したエレクトロポレーション混合物を加えて細胞を再懸濁します。軽く上下にピペットでピペットをかけます。

エレクトロポレーション:細胞エレクトロポレーション混合物については、ピペット付きの10マイクロリットルのヌクレオフフェクションチップを使用します。

重要:ピペッティング中に気泡が発生すると、エレクトロポレーションの失敗の原因となりますので避けてください。「開始」を押します。

エレクトロポレーション後、予熱した増殖培地を含む24ウェルプレートの1つのウェルにサンプルを移します。残りの4つの反復サンプルで、上記と同じエレクトロポレーション手順を実行します。プレートをそっと揺らして、細胞が均一に分布するようにします。FACS細胞選別の前に、細胞を37度のインキュベーターで48〜72時間インキュベートします。