CreER-LoxPシステムに基づく標的遺伝子の不活性化:マウスモデルにおける標的遺伝子ノックアウトのためのタモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼシステム

目的

の遺伝子に隣接するLoxP部位(Cre-リコンビナーゼ酵素によって認識される特定の配列)を保有する改変ゲノムを含む遺伝子操作マウスモデルから始めます。マウスにさらに、臓器特異的CreERリコンビナーゼをコードするプラスミドベクターをトランスフェクトし、CreERリコンビナーゼ発現要素を肝細胞のゲノムに組み込む。

発現したCreERリコンビナーゼは、Creリコンビナーゼとエストロゲン受容体ERの変異リガンド結合ドメインが関与する不活性融合タンパク質であり、細胞質内の熱ショックタンパク質と相互作用して結合します。この結合により、CreERリコンビナーゼが細胞質に閉じ込められます。

エタノールと適切な油を使用して、疎水性薬であるタモキシフェンの溶液を調製します。次に、腹部臓器の損傷を防ぐために、タモキシフェン溶液をマウスの腹部の左下象限に腹腔内に注射します。

注射されたタモキシフェンは、肝臓で 4-ヒドロキシタモキシフェン、4-OHT に代謝されます。さらに、選択的エストロゲン受容体モジュレーターである4-OHTは、CreERリコンビナーゼのERリガンド結合ドメインに結合し、そのコンフォメーション変化を引き起こします。これにより、熱ショックタンパク質からCreERリコンビナーゼが放出されます。

活性化されたCreERリコンビナーゼは核に転座し、宿主ゲノムのLoxP部位を認識します。CreER組換え酵素は、LoxP部位間の部位特異的組換えを触媒し、目的の遺伝子を切除し、それによって組織特異的遺伝子ノックアウトを達成します。

尾静脈注射の10〜15日後にCreリコンビナーゼの誘導を開始し、非統合ベクターのクリアランスを可能にします。10ミリグラムのタモキシフェンを40マイクロリットルのエタノールに溶解し、摂氏55度で振とうしながら10分間インキュベートします。

タモキシフェンが溶解するまで数回渦巻き、次に960マイクロリットルのコーン油を加え、摂氏55度で5分間インキュベートします。冷却後、溶液を 1 ゲージの針で 20 ミリリットルのインスリン注射器に引き込み、27 ゲージの針に変更します。

注射するには、まず、親指と2本目の指でマウスの首を注意深くつかみ、手の付け根と4本目と5本目の指の間に尾を固定してマウスを首筋にし、次に、腹腔内に0.1ミリリットルの溶液を腹部の左下象限に注入します。