インビボでの誘導性Tet-On調節可能なシステムベースの遺伝子発現:マウスモデルにおける標的遺伝子転写活性化のためのテトラサイクリン誘導遺伝子発現システム

テトラサイクリンオンまたはテトオンシステムは、テトラサイクリンまたはその類似体であるドキシサイクリンの存在下で目的の遺伝子の発現を活性化する条件付き遺伝子発現システムです。

肝細胞または肝細胞の肝臓特異的プロモーターによって駆動される、逆テトラサイクリン制御転写活性化タンパク質(rtTA)をコードする遺伝子を含む改変ゲノムを持つ遺伝子操作マウスから始めます。さらに、マウスには、上流に位置し、最小限のプロモーターに選択的に融合したテトラサイクリンオペレーターまたはtetO配列の制御下にある目的の遺伝子が含まれています。tetOとプロモーターは、テトラサイクリン応答性エレメント(TRE)と呼ばれます。

発現したrtTA(tetレプレッサー、tetR、およびウイルスタンパク質VP16トランス活性化ドメインを含む融合タンパク質)は、不活性でTREのtetO配列に結合できず、標的遺伝子発現の活性化を妨げる二量体を形成します。

ドキシサイクリンとスクロースを含む溶液を調製します。ショ糖の添加により嗜好性が向上します。ろ過後、ドキシサイクリン-スクロース溶液を飲料水としてマウスに提供します。投与されたドキシサイクリンは肝臓に蓄積します。

肝細胞では、ドキシサイクリンがrtTAに結合し、構造変化を引き起こし、tetO DNA結合部位に対する親和性を高めます。ドキシサイクリン結合rtTAのtetR DNA結合ドメインはTREエレメントのtetO配列に結合するVP16ドメインはさらにRNAポリメラーゼを動員し、転写、mRNAの形成、およびその後の下流レポーター標的遺伝子の発現につながります。

10日未満の実験では、以下のプロトコルを使用して飲料水を介してドキシサイクリンを継続的に投与します。まず、5グラムのスクロースを100ミリリットルの水道水に溶かし、オートクレーブします。

次に、100ミリグラムのドキシサイクリンヒクレートを15ミリリットルのコニカルチューブ内の5ミリリットルのスクロース溶液に溶解します。次に、10ミリリットルの注射器を使用して、0.2ミクロンのフィルターを通して溶液を滅菌ろ過し、次に、ろ過したドキシサイクリン溶液を残りの95ミリリットルのスクロース溶液に加え、飲料水の代わりに溶液をマウスに供給します。毎日チェックし、溶液が濁った場合は細菌の異常増殖を示しているため、すぐに交換してください。