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低分子干渉RNA(二本鎖RNAの一種であるsiRNA)を非接着脂肪細胞または脂肪細胞に逆トランスフェクションするには、脂肪細胞内の特定のタンパク質をコードする遺伝子を標的とするsiRNAの懸濁液を調製します。適切なカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を追加します。混合物をインキュベートし、静電相互作用を介してトランスフェクション複合体を形成します。
混合物をマルチウェルプレートのコラーゲンでコーティングされたウェルに移します。トランスフェクション複合体は、非特異的相互作用によってプレートコーティング上に固定化されます。固定化されたトランスフェクション複合体を含むウェルに脂肪細胞の懸濁液をピペットで移動させます。脂肪細胞はプレートコーティングに緩く付着し、細胞と複合体の間の物理的接触を増加させます。
トランスフェクション複合体は細胞膜に融合し、siRNAを細胞質に送達します。siRNAは、mRNAを標的とする相補的な配列を持つアンチセンス鎖とセンス鎖で構成され、マルチタンパク質RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によって認識されます。siRNAはRISCに結合し、鎖は分離し、アンチセンス鎖は複合体に結合したままになります。
活性化されたsiRNA-RISC複合体は、標的mRNA上の相補部位を認識して結合します。これにより、RISC 複合体のアルゴノートタンパク質による mRNA の配列特異的切断が起こります。切断されたmRNAは細胞機構によってさらに分解され、それによって標的遺伝子発現が沈黙します。
改良された最小必須培地でsiRNAをピペットで混合し、室温で5分間インキュベートします。トランスフェクション試薬と改良されたミニマルエッセンシャル培地をsiRNAに加え、ピペットで混合します。室温で20分間インキュベートします。次に、トランスフェクションミックスをコラーゲンコーティングプレートの各ウェルに加えます。
100ミリメートルのペトリ皿内の細胞をDPBSで2回洗浄します。細胞に 5X トリプシンを加え、表面全体をトリプシンで覆うようにします。30秒待ってから、トリプシンを慎重に取り除きます。ペトリ皿をインキュベーター内で37°Cで5〜10分間インキュベートします。
次に、皿を軽くたたいて細胞を剥がし、細胞の損傷を防ぎます。ピルビン酸を含まないDMEM10ミリリットル、グルコース25mM、FCS10%、ペニシリンとストレプトマイシン1%を加えて、トリプシンを中和します。培地を慎重に上下にピペットで移動させ、細胞を分離し、細胞懸濁液を均質化します。
マラセス計数チャンバーまたは自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、細胞の濃度を6.25 x 105細胞/mLの培地に調整します。12ウェルプレートのウェルあたり800マイクロリットルの細胞懸濁液、またはトランスフェクションミックスを含む24ウェルプレートのウェルあたり400マイクロリットルの細胞懸濁液を播種します。
プレートを細胞培養インキュベーターでインキュベートし、24時間邪魔しないでください。翌日、上清をピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含まない新鮮なDMEMに慎重に交換し、細胞をインキュベーターに戻します。