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マイクロインジェクションモールドのウェルに入れられた生存可能な1細胞段階のゼブラフィッシュ胚から始めます。
マイクロインジェクション針に、Tol2トランスポザーゼをコードするmRNAとトランスポゾンドナープラスミドを含む溶液をロードします。プラスミドは、ユビキタスゼブラフィッシュプロモーターと、Tol2トランスポゾンアームに隣接する蛍光タンパク質をコードする遺伝子で構成されています。
マイクロインジェクション溶液をゼブラフィッシュ胚の細胞質に慎重に注入します。細胞内では、Tol2トランスポザーゼmRNAはTol2トランスポザーゼタンパク質に翻訳され、核に活発に輸送されます。
ドナープラスミド上のTol2部位は、レポーター遺伝子に隣接する特定の逆末端リピート(ITR)で構成されています。ITRの両側には、短く直接的な繰り返しがあります。トランスポザーゼタンパク質はITR部位を認識して結合し、隣接するDNAにヘアピンを形成します。トランスポザーゼは、トランスポゾン構築物を隣接するDNAからさらに切断し、プラスミドから放出し、短い直接の繰り返しを残します。
トランスポザーゼは、体細胞ゲノムに千鳥状の二本鎖切断を作成し、トランスポゾン構築物をゲノム部位に挿入します。DNAポリメラーゼによる千鳥状末端のギャップ充填とそれに続くニックのライゲーションは、短く直接的な繰り返しを作成します。
ライゲーションは、体細胞ゲノムへの安定したトランスポゾンコンストラクトの組み込みを引き起こし、プロモーターは蛍光タンパク質の発現を促進します。注入された胚をインキュベートします。胚発生中に、体細胞はさまざまな種類の細胞を生成し、トランスジェニックゼブラフィッシュを作成します。
Tol2トランスポザーゼmRNAと注射液を調製した後、テキストプロトコルに従って、注射前の午後に、少なくとも2匹のオスと2匹のメスを含む4〜6つの繁殖タンクを設置しました。魚の排泄物の量を減らし、繁殖反応を誘発するために、午後の魚への餌やりは避けてください。
翌朝、準備した注射液をマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置きます。魚の繁殖水槽の仕切りを引っ張って、魚が交尾できるようにします。一般的に、魚は20〜30分以内に卵を産
みます。待機中に、次のパラメータを持つマイクロピペットプーラーを使用して、毛細管ガラスから針を抜きます。実験室用ワイプを使用して針の端を壊し、面取りされたエッジを作成します。胚死亡率を減らすには、直径が小さいことが好ましい。
魚が卵を産んだら、直径10センチのシャーレに集めます。解剖顕微鏡の直下で、異常な胚と魚の排泄物をすべて取り除きます。次に、受精胚を準備した3%アガロース射出成形金型にピペットで入れます。胚を所定の位置に保つために余分な水分を取り除きます。
すべての列が生存可能な胚で満たされたら、単一細胞がすべて針に対して水平に45度の角度で向けられるように配置します。これにより、後で注射がはるかに簡単になります。次に、手袋を着用した状態で、20マイクロリットルのローディングピペットチップを使用して、準備したコンストラクトの5マイクロリットルを氷上のチューブから取り除きます。
ピペットチップを、壊れた毛細管の後端に慎重に挿入し、試薬を先細りになり始めるところまで挿入し、試薬を先端にできるだけ近づけ、毛細管管に排出します。まだ気泡がある場合は、先端が折れないように針を振ってください。
マイクロインジェクション針ホルダーに針をまっすぐ挿入し、針が所定の位置に留まるまで慎重に締めてから、角度を約45度に調整します。針を準備して取り付けたら、顕微鏡とガス圧タンクの電源を入れます。保持に約0.5 PSI、排出に約30 PSIを使用して、注入量を調整します。
ペダルを踏んだときに溶液が針から排出されることを確認してください。鉱物油を一滴垂らしたステージマイクロメーターを使用して、溶液の体積と流量を直径約10マイクロメートルに調整します。背圧により、少量の溶液が針から滴り落ちることを確認してください。
背圧が十分でない場合、毛細管現象により液体が針に入り、mRNAが破壊されます。針が校正されたら、ゲルノッチの端を使用して受精胚の単一細胞に針を挿入し、胚を所定の位置に保持し、胚を動かさずに針が圧力を加えることができるようにします。
針の先端が単一セルに入ったら、ペダルを踏んで必要な量の溶液を放出します。トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するには、卵黄ではなく、溶液を細胞に注入することが重要です。すべての胚に対してこのプロセスを繰り返します。
完了したら、使い捨ての3.4ミリリットルのトランスファーピペットとフィッシュシステム水を使用して、注入された胚をアガロースノッチから洗い流してラベル付けされた皿に移します。胚を摂氏28.5度のインキュベーターに保管して発育させます。