ヒトiPS細胞におけるPiggyBacトランスポゾン媒介遺伝子編集:PiggyBacトランスポゾンシステムを用いたヒトiPS細胞への目的遺伝子統合の手順

ヒ

ト人工多能性幹細胞(hiPSC)を適切なエレクトロポレーションバッファーに懸濁することから始めます。PiggyBacトランスポザーゼをコードするプラスミドとドナープラスミドからなる溶液を追加します。混合物をエレクトロポレーションします。

電気パルスは一時的に細胞膜を透過し、プラスミドの細胞取り込みを促進します。ドナープラスミドは、トランスポゾン特異的逆末端リピート(ITR)を含み、互いに逆相補であり、標的タンパク質と抗生物質耐性遺伝子をブラケットするTTAAリピートが隣

接しています。

発現したPiggyBacトランスポザーゼタンパク質は、TTAAリピートの内部にあるITRの3'末端にニックを作成します。露出した3'-ヒドロキシル基は、隣接するDNA内の相補鎖のヌクレオチドを攻撃し、トランスポゾン末端にTTAAヘアピンを形成し、それによってプラスミドからトランスポゾン構築物を放出します。

トランスポザーゼはヘアピンを分解して、トランスポゾンコンストラクトの5'末端にTTAAオーバーハングを形成します。トランスポザーゼはさらに、宿主ゲノムのTTAA配列に二本鎖切断を作成します。放出された3'-ヒドロキシルトランスポゾン末端は、千鳥状末端でTTAA配列を攻撃し、その結果、トランスポゾンコンストラクトが宿主ゲノムに共有結合し、トランスポゾンコンストラクトに隣接する一本鎖ギャップを残します。宿主DNAのこれらのギャップはライゲーションされ、トランスポゾン構築物の安定した統合につながります。

細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされたプレートに播種されたhiPS細胞を抗生物質含有培地で処理します。上流のプロモーターによって駆動される抗生物質耐性遺伝子は、遺伝子編集細胞の選択を可能にします。

ヒトiPS細胞培養物をカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSですすぎ、細胞解離試薬で細胞を摂氏37度で5〜10分間処理します。細胞が培養容器から剥離し始めたら、P1000ピペットを使用して、細胞を3〜4回手動で穏やかに解離します。

細胞を15ミリリットルのチューブに移し、カルシウムとマグネシウムを含まない新鮮なPBSで最終容量を最大10ミリリットルにしてカウントします。遠心分離によって1 x 10⁶細胞を収集し、エレクトロポレーションキットからペレットを100マイクロリットルのバッファーRに再懸濁します。

トランスフェクション用に4.5マイクログラムの転移性ベクタープラスミドDNAと0.5マイクログラムのPiggyBacトランスポザーゼプラスミドDNAを加えます。製造元の指示に従って、指定されたパラメータを使用して、細胞エレクトロポレーションシステムでトランスフェクトします。そうしたら。10マイクロモルのROCK阻害剤Y-27632を添加したヒトiPS細胞培地に細胞を6