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CRISPR-concatemer-Cas9システムを使用して複数の遺伝子を同時にノックアウトするには、マウス腸管細胞懸濁液を含むチューブから始めます。チューブに、隣接して統合された複数のガイドRNA(gRNA)の発現カセットを含むCRISPR-concatemerベクターを
補充します。各gRNAカセットは、目的の遺伝子を個別にノックアウトするようにカスタム設計されています。Cas9エンドヌクレアーゼをコードする発現ベクターを同じチューブに追加します。細胞 - プラスミド混合物をエレクトロポレートする - 電流を使用してプラスミドの細胞への侵入を促進する技術。細胞内では、CRISPR-concatemerとCas9ベクターの共発現により、それぞれgRNA配列とCas9ヌクレアーゼが形成されます。
各gRNA配列は対応するCas9酵素に結合し、宿主ゲノムの標的部位に付着する複数のCas9-gRNA複合体を形成します。この結合によりCas9酵素が活性化され、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)部位の上流の両方のDNA鎖にニックが生じます。これにより、標的DNAに二本鎖切断(DSB)が発生します。
標的遺伝子との相同配列がない場合、非相同末端結合と呼ばれる細胞の内因性修復メカニズムがトリガーされ、修復タンパク質とキナーゼ分子が切断部位で結合できるようになります。その後、リガーゼ酵素がDSBを修復し、標的遺伝子配列の修飾をもたらします。これらの修飾は遺伝子の機能を破壊し、複数の遺伝子のノックアウトをもたらします。
細胞懸濁液を含む15ミリリットルのチューブに9ミリリットルの還元血清培地を加えることからこの手順を開始し、室温で400Gで3分間遠心分離します。すべての上清を取り除き、ペレットをエレクトロポレーション溶液に再懸濁します。合計10マイクログラムのDNAを2本の新しいチューブに加えます。次に、エレクトロポレーション溶液を最終容量100マイクロリットルまで添加し、細胞-DNA混合物を氷上に保持します。
細胞-DNA混合物をエレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットをエレクトロポレーターチャンバーに入れます。エレクトロポレーターの適切なボタンを押してインピーダンスを測定し、0.030〜0.055オームであることを確認します。テキストプロトコルに示されている設定に従ってエレクトロポレーションを実行します。400マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーとROCK阻害剤をキュベットに加え、その内容物をすべて1.5ミリリットルのチューブに移します。
細胞が回復するまで、室温で30分間インキュベートします。30分後、室温で400Gで3分間回転させる。上清を取り除き、ペレットを基底マトリックスのウェルあたり20マイクロリットルに再懸濁します。48ウェルプレートにウェルあたり約1 x 104〜1 x 105細胞を播種し、EGFとNoggin GSK-3阻害剤、ROCK阻害剤、および1.25%ジメチルスルホキシド培地を加えます。摂氏37度でインキュベートします。