抗原-抗体相互作用を単一分子レベルで研究するための質量測光

質量測光法を使用して抗原と抗体の相互作用を検出するには、まず、所望の濃度の精製抗原と抗体を必要な時間インキュベートし、抗原と抗体の結合を促進します。抗原結合の化学量論に基づいて、これらの抗体のパラトープ領域は、さまざまな数の抗原が付着している可能性があります。

遊

離抗体と抗原-抗体複合体を含む溶液を、事前に組み立てられたフローチャンバーを通って流れます。チャンバーを質量光度計の顕微鏡ステージに固定します。次に、最適なイメージングのためにレーザービームをフローチャンバーに向けます。

各抗体に結合した抗原の数に応じて、複合体の分子量が変化します。これらの質量の変化により、複合体の光の散乱が異なります。

2つの抗原が単一の抗体の両方のパラトープに結合している高分子量の複合体は、単一の抗原を含む複合体と比較してより多くの光を散乱します。さらに、遊離抗体は光散乱の量が最も少ないです。

検出器は散乱光を収集し、その周波数と強度を測定します。光度計は、散乱光の変動を干渉パターンとして記録し、これをスポットとして表します。

かすかな斑点は遊離抗体に対応します。対照的に、非常に暗い斑点は2つの抗原を持つ複合体を表し、あまり暗い斑点は1つの結合抗原を含んでいます。

ダークスポットの存在は、抗原と抗体の相互作用に準拠しています。

質量測光法で抗体と抗原の親和性を評価するには、顕微鏡浸漬油を機器の対物レンズに一滴塗布し、フローチャンバーを顕微鏡のステージに置きます。10マイクロリットルのろ過されたPBSをフローチャンバーチャネルの一端に加えます。バッファーは毛細管現象によってチャネルに入ります。

データ収集ソフトウェアのフォーカスコントロールタブで、粗いステージの動きの上ボタンと下ボタンを使用して初期調整を行い、シャープネスをクリックしてシャープネス信号の読み出しを表示します。細かい上下調整ボタンを使用してシャープネス値を最大化し、[フォーカスの設定]と[フォーカスのロック]をクリックしてフォーカストラッキング機能を有効にします。クリーンなスライドの画像は、0.05%以下の「シグナル」値を持つ必要があります。

実証されているように、最初の抗体抗原サンプルを20マイクロリットルロードし、もう一方の端から小さなあぶらとり紙で液体を吸い取ります。読み込み後すぐに [記録] をクリックして、100 秒分のデータに相当する適切なフレーム数を取得します。データ収集期間の終了時に、データのファイル名を入力し、[OK]、[サンプル]の順にクリックしてファイルを保存します。

質量測光データを解析するには、目的のファイルを開き、[解析]をクリックします。[ロード]をクリックしてキャリブレーション関数をロードし、[ファイル]と[名前を付けて結果を保存]をクリックして解析データを保存します。

サンプル中の