In Situタンパク質間相互作用を研究するための近接ライゲーションアッセイ

解剖

した線虫を採取し、生殖細胞を露出させたスライドに固定することから、近接ライゲーションアッセイを開始します。これらの細胞は、パートナータンパク質に関連するRNA結合タンパク質(RBP)を含む高レベルのリボ核タンパク質複合体を示します。

2つの特定の標的タンパク質(RBPとそのパートナータンパク質)を認識する2つの一次抗体をスライドに重ね合わせます。スライドに、それぞれの一次抗体に特異的な2種類の二次抗体を補完します。

各二次抗体は、PLAプローブ(相補的な配列を持つDNA鎖)と結合しています。二次抗体は事前に付着した一次抗体に結合し、2つのPLAプローブを近づけます。

PLAプローブとハイブリダイズするコネクタオリゴヌクレオチドを含むライゲーションバッファーを適用すると、リガーゼ酵素がギャップを塞ぎ、環状DNAを生成します。スライドを、赤色蛍光色素に結合したDNAポリメラーゼ、dNTP、および検出器プローブを含む増幅溶液でインキュベートします。

環状化DNAをテンプレートとして使用すると、ポリメラーゼはローリングサークル増幅を開始し、互いに接続されたテンプレートDNAの多くのコピーを生成します。増幅されたDNAはPLAプローブに繋がれたままであり、タンパク質間相互作用の局在化を可能にします。

短い一本鎖オリゴヌクレオチドを運ぶ検出器プローブは、増幅されたDNAの相補領域と相互作用し、二本鎖を形成し、タンパク質複合体に蛍光シグナルを与えます。蛍光顕微鏡でスライドを画像化します。

細胞内に明確な赤い斑点がないか観察し、タンパク質間相互作用が成功していることを示します。

抗体希釈液を使用して一次抗体を希釈します。14 x 14 mmのスペースあたり40マイクロリットルの希釈一次抗体溶液をスライドに塗布します。スライドを湿気の多いチャンバーに入れ、摂氏4度で一晩インキュベートします。

朝、コプリンジャーで室温で50ミリリットルの1x洗浄バッファーAでスライドを5分間2回洗浄します。60 RPMに設定されたオービタルシェーカーのCoplinジャーに設定します。スライドをペーパータオルの上に置き、洗浄バッファーをスライドから流し、端を優しく拭きます。

プラスおよびマイナスのプローブを含む40マイクロリットルの溶液を調製します。14 x 14 ミリメートルの各スペースに溶液を追加します。スライドを湿気の多いチャンバー内で摂氏37度で1時間インキュベートします。スライドを50ミリリットルの1x洗浄バッファーAでそれぞれ5分間2回洗浄し、コプリンジャーに入れます。

60 RPMに設定されたオービタルシェーカーのCoplinジャーに設定します。ライゲーションバッファーを超純水で1〜5に希釈します。このバッファーを使用してリガーゼを1〜40に希釈し、ライゲーション溶液のワーキングストックを調製します。スライドをペーパータオルの上に置き、洗浄バッファーが側面から流れ落ちるようにし、端を優しく拭きます。

40マイクロリットルのライゲーション溶液を14 x 14ミリメートルのスペースごとに加えます。スライドを湿ったチャンバー内で摂氏37度で30分間インキュベートします。前述のようにスライドを洗浄して乾燥させた後、光から保護された新しく調製した増幅液40マイクロリットルを14 x 14ミリメートルのスペースごとに加えます。

スライドを湿った暗室で摂氏37度で1時間40分間インキュベートします。スライドを50ミリリットルの1x洗浄バッファーBでそれぞれ10分間2回洗浄し、スライドを50ミリリットルの0.01x洗浄バッファーBで1分間1分間

洗浄します。

スライドのエポキシコーティングされた周囲を描いた後、各サンプルに10マイクロリットルの封入剤を加え、その上にカバーガラスをそっと置き、封入剤を広げます。カバーガラスの端の周りをマニキュアでペイントして、カバーガラスとスライドを密閉します。カバーガラスを動かさないでください。マニキュアを光から保護した室温で少なくとも20分間固めます。