相互作用研究のための共免疫沈降タンパク質の調製のための膜上タンパク質消化

膜上消化を行うには、パートナータンパク質に関連する組換えGFPタグ付き標的タンパク質を含む共免疫沈降タンパク質複合体の溶液を取ります。

タンパク質を事前に湿潤したポリ二フッ化ビニリデン、PVDFメンブレンを含むチューブに移し、インキュベートします。PVDF膜の親水性表面は、タンパク質を膜に移すのに役立ちます。

タンパク質含有膜を新しいチューブに移します。還元剤を含む緩衝液を添加して、システイン残基間のジスルフィド結合を還元し、複合体の相互作用を妨げることなく複合体内の個々のタンパク質を変性させます。

この溶液をアルキル化試薬に置き換えると、複合体内の両方のタンパク質のスルフヒドリル基がアルキル化され、ジスルフィド結合の再形成が防止されます。メンブレンを洗浄して余分な試薬を取り除きます。

タンパク質分解酵素であるトリプシンを含む緩衝液で膜を処理します。トリプシンは、アルギニン残基とリジン残基のカルボキシル末端でGFPタグ付き標的タンパク質とそのパートナータンパク質を切断し、より小さなペプチドを上清に放出します。上清を新しいチューブに移します。

メンブレンを酸性溶液で洗浄し、結合したペプチドをメンブレンから解離させ、完全に抽出します。ペプチド含有画分を1本のチューブに引き込みます。真空乾燥により乾燥します。

残

基を低濃度のギ酸に再懸濁し、ペプチドを溶解し、タンパク質間相互作用の同定の準備が整います。

メンブレンを準備するには、使用直前に洗浄した外科用ハサミを使用して、PVDFメンブレンを3ミリメートル×3ミリメートルの断片にカットします。膜片をアルミホイルの上に置き、各片に2〜5マイクロリットルのエタノールを加えます。メンブレンが完全に乾く前に、各部分に2〜5マイクロリットルのタンパク質溶離液を加え、メンブレン表面がつや消しになるまで自然乾燥させます。

次に、メンブレンを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で保管します。すぐに使用する場合は、2〜30マイクロリットルのエタノールを加えると、親水性になります。ピペットでエタノールを取り除きます。ただし、膜が乾く前に、各チューブに200マイクロリットルのDTTベースの反応溶液を完全に加え、摂氏56度で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、反応溶液を300マイクロリットルのヨードアセトアミド溶液と交換し、暗所で45分間インキュベートします。次に、メンブレンを蒸留水で2回洗浄し、2%アセトニトリルで1回、少なくとも10秒間ボルテックスします。

ジチオスレイトールとアセトニトリルの操作は非常に危険です。膜上消化手順を実行するときは、マスク、メガネ、手袋を常に着用する必要があります。

原稿の指示に従ってトリプシンを調製し、各膜に100マイクロリットルのトリプシン反応溶液を加えます。消化のために摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、反応溶液を清潔な1.5ミリリットルチューブに移し、100マイクロリットルの洗浄溶液をメンブレンに加えます。メンブレンを摂氏60度で2時間インキュベートします。

次に、洗浄液を回収し、反応液と混合します。さらに100マイクロリットルの洗浄溶液をメンブレンに加え、10分間超音波処理します。次に、洗浄液を回収し、反応液と混合します。試験管を実験用フィルムで覆い、針でフィルムに小さな穴を開けます。

真空濃縮器を使用して溶液を乾燥させ、残留物を10マイクロリットルの0.2%ギ酸に溶解します。チューブを12,000 x g で3分間遠心分離し、上清をサンプルチューブに移します。

nano-LC HPLCシステムにリンクされた質量分析計を使用してサンプルを分析します。