タンパク質間相互作用を検出するためのビオチン化細胞透過性ペプチドプローブ

細胞内では、タンパク質は構造内の特定の配列を介して相互作用するタンパク質に結合し、細胞内タンパク質の機能を調節します。

細胞内タンパク質相互作用を検出するには、接着細胞培養を行います。培地を吸引します。

ビオチン化細胞浸透ペプチド、BCPP溶液を加え、インキュベートします。

各BCPPには、標的の細胞内タンパク質への特異的結合を助けるペプチド配列が含まれています。このペプチドは、ペプチドのN末端に細胞浸透性ペプチドCPPを持ち、C末端にビオチンを含み、検出を容易にします。

インキュベーション中、正に帯電したCPP領域は、細胞膜を通る結合ペプチドの侵入を促進し、細胞質に到達します。ペプチドは、細胞内相互作用タンパク質パートナーに結合し、BCPP標的タンパク質複合体を形成します。

細胞膜を破裂させ、BCPP標的タンパク質複合体やその他の細胞成分を放出する界面活性剤分子を含む緩衝液を追加します。

アガロースビーズ結合アビジン(BCPPのビオチンに特異的に結合する糖タンパク質)の溶液を加えます。インキュベートすると、アビジンがビオチンに不可逆的に結合し、アビジン-BCPP標的タンパク質複合体が精製されます。

遠

心分離機でビーズをペレット化します。ビーズをバッファーに再存在させてタンパク質間の非共有結合を切断し、ビオチン-アビジンビーズからCPP-ペプチド-タンパク質複合体を溶出します。

CPP-ペプチド-タンパク質複合体をウェスタンブロッティングで分析します。CPP-ペプチド-タンパク質複合体の分子量バンドが複合体の成分よりも高いということは、相互作用するタンパク質パートナー間の相互作用が成功していることを示しています。

BCPPのストック溶液の体積を細胞培養物に加えて、有効であることが証明されている濃度に達します。

したがって、培地1ミリリットルあたり2ミリリットルのTAT-Connexin-43_266-283-ビオチンを92.8マイクロリットル添加します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに30分間入れて、BCPPとその細胞内パートナーとの間の相互作用が確実に行われるようにします。

タンパク質抽出を行うには、まず培地を完全に吸引します。次に、細胞の剥離を避けるために、150センチメートルあたり10ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。

細胞溶解液を得るには、150平方センチメートルのフラスコあたり3ミリリットルの溶解バッファーを加え、細胞スクレーパーを使用して表面を完全にこすります。フラスコを約45度に傾けると、細胞溶解物を対応するチューブに集めやすくなります。

チューブあたり1ミリリットルの細胞溶解物を、条件ごとにマークされた3本の1.5ミリリットルチューブに注ぎます。プルダウンの場合は、1.5ミリリットルのチューブを摂氏4度で10分間11,000 x g で遠心分離します。

上清をAとラベル付けされた新しいチューブに移します。条件ごとに上清のアリコートをBとラベル付けされた別のチューブに移します。次に、50マイクロリットルのライセートに対して16.6マイクロリットルの4x Laemmliバッファーを加え、摂氏マイナス20度で凍結します。次に、穏やかに振とうしてNeutrAvidinアガロースを非常によく均質化します。

ピペットチップの先端を切断して直径を大きくし、ビーズのピペッティングを改善します。次に、細胞溶解物1ミリリットルあたり50マイクロリットルのNeutrAvidinアガロースをAチューブに加えます。細胞ライセートを摂氏4度で一晩インキュベートし、NeutrAvidinが細胞内パートナーに結合したBCPPと相互作用できるようにします。

次に、摂氏4度で3,000倍gで1分間遠心分離し、NeutrAvidinとタンパク質の複合体を回収します。上清を慎重に取り除き、Cとラベル付けされた清潔なチューブに移します。プルダウンが成功しない場合に備えて使用してください。

NeutrAvidinの複合体をタンパク質で洗浄するには、Aチューブのペレットに新鮮な溶解バッファーを加えます。ペレットを反転して再懸濁し、遠心分離を繰り返します。この洗浄をさらに5回繰り返します。これらの上清はすべて廃棄できます。

次に、コンフルエント細胞の150平方センチメートルのフラスコから得られたペレット用に、1.5ミリリットルチューブあたり40マイクロリットルの2x Laemmliバッファーを追加します。次に、摂氏100度で5分間溶出して、タンパク質間の相互作用を解離させます。

溶出後、8,200 g で 30 秒間遠心分離して、NeutrAvidin ビーズをペレット化します。毛細管管先端を持つ解離タンパク質を含む上清を、Dと標識された新しいチューブに移します。

これらの上清は、テキストプロトコルに記載されているようにウェスタンブロットにロードする準備が整ったか、摂氏マイナス20度で凍結することができます。