酵母細胞におけるタンパク質自己会合を決定するための酵母2ハイブリッドアッセイ

酵母2ハイブリッドアッセイでは、転写活性化タンパク質であるGAL4を欠く遺伝子操作された活発に増殖する酵母細胞懸濁液を使用します。これらの細胞はロイシンとトリプトファンを合成できません。

対の発現プラスミドを追加します:1つはロイシンとGAL4のDNA結合ドメインであるDNA-BDをコードし、標的タンパク質ドメインに融合し、もう1つはトリプトファンとGAL4の活性化因子ドメインであるADをコードし、標的タンパク質の別のドメインに融合します。

形質転換に適した薬剤を含むバッファーを追加します。細胞に熱ショックを与えて一過性の細孔形成を引き起こし、細胞プラスミドの取り込みを促進します。冷やして毛穴を再密閉します。ロイシンとトリプトファンを欠く選択的増殖培地に細胞をプレーティングします。

2つのハイブリッドタンパク質を発現する形質転換細胞は、ロイシンとトリプトファンを合成し、生き残り、コロニーを形成します。

タンパク質ドメインに融合したDNA-BDは、β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子プロモーター領域の特定の上流DNA配列に結合します。標的タンパク質ドメインが相互作用すると、ADとDNA-BDが近づき、機能的なGAL4の再構成を引き起こし、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現につながります。

コロニーをろ紙に移します。細胞を凍結融解して溶解し、β-ガラクトシダーゼを放出します。この濾紙を、β-ガラクトシダーゼ基質を浸した別の濾紙の上に置きます。

放出されたβ-ガラクトシダーゼは、基質をガラクトースと不安定な生成物に加水分解し、二量体化して酸化してろ紙上に青い沈殿物を形成し、標的タンパク質ドメインの相互作用を示します。

この酵母2ハイブリッドアッセイでは、対数期中期の酵母細胞を形質転換に使用します。遠心分離によって細胞を回収します。各ペレットを5ミリリットルの滅菌水に再懸濁し、細胞懸濁液をプールします。細胞懸濁液を遠心分離します。

上清を廃棄した後、酵母ペレットを1ミリリットルの新しく調製した滅菌1X酢酸リチウムとTEに再懸濁します。コンピテント酵母細胞は、調製後1時間以内に使用する必要があります。ベイトとターゲットプラスミドDNAを100マイクログラムのニシン精巣キャリアDNAと混合することにより、プラスミドサンプルを調製します。

各1.5ミリリットルチューブに、100マイクロリットルのコンピテント酵母懸濁液と600マイクロリットルの1X酢酸リチウムとPEG溶液を加え、約30秒間ボルテックスします。摂氏30度で振とうしながら30分間インキュベートします。80マイクロリットルのジメチルスルホキシドを加え、穏やかな反転でよく混ぜます。

摂氏42度の水浴で15分間ヒートショックし、2〜3分ごとに混合します。細胞懸濁液を氷上で2分間冷却し、その後、遠心分離して酵母を回収します。各細胞ペレットを100マイクロリットルの1X TEに再懸濁します。適切な最小SD培地プレートに細胞をプレーティングして、ベイトプラスミドとターゲットプラスミドの両方に選択圧を維持します。プレートを摂氏30度で逆さまにして4〜5日間インキュベートします。

酵母コロニーは、直径が約2ミリメートルになると、このアッセイの準備が整います。調製したばかりのZ-BufferとX-Gal溶液を2.5ミリリットルの清潔な100ミリメートルプレートにピペットで移し、セルロースろ紙をプレートに入れます。アッセイする酵母コロニーを含むプレートの表面に新しいろ紙を置きます。鉗子を使用して濾紙をプレートにそっとこすりつけ、コロニーが付着するまで約5分間放置します。

適切な個人用保護具を使用しながら、濾紙を慎重に持ち上げ、液体窒素のプールに30秒間浸します。冷凍ろ紙を室温で2分間解凍します。100mmプレート内のあらかじめ浸したろ紙の上にコロニー側を上にしてろ紙を置き、青いコロニーが現れるまで摂氏30度でインキュベートします。