タンパク質間相互作用を研究するためのタンデムアフィニティー精製アッセイ

タンデムアフィニティー精製は、タンパク質複合体を細胞から単離してタンパク質間相互作用を研究するための逐次精製スキームです。

まず、目的のエピトープタグ付きタンパク質を発現する細胞培養を取ります。タンパク質は細胞内で複合体を形成します。複合体内のタンパク質の1つは溶連菌タグを含み、もう1つはFLAGタグで標識されています。これらは、小さな合成ペプチド配列ベースのアフィニティータグです。

培地を取り除き、界面活性剤溶液を加えて細胞を溶解します。遠心分離機で細胞破片を除去します。標的タンパク質複合体と他の細胞タンパク質を含む上清を収集します。

連鎖球菌ビーズ(ストレプトアビジンでコーティングされたアガロースビーズ)を加え、インキュベートします。タンパク質複合体の連鎖球菌タグはストレプトアビジンに結合します。遠心分離してタンパク質複合体に結合したビーズを収集します。洗浄して汚染された細胞タンパク質を除去します。

レプトアビジンに競合的に結合することによりタンパク質複合体を置換するデスチオビオチン(ビオチン誘導体)を含む溶出バッファーを追加します。溶出したタンパク質複合体を含む上清を得るために遠心分離します。

FLAGビーズ(抗FLAG抗体でコーティングされたアガロースビーズ)を加えてインキュベートします。タンパク質複合体のFLAGタグは抗体に結合します。遠心分離してタンパク質複合体に結合したビーズを収集します。

遊離FLAGペプチドを含む溶出バッファーを添加します。ペプチドは抗体に競合的に結合し、結合したタンパク質複合体を置換します。精製されたタンパク質複合体を溶出するために遠心分離します。

溶出中の両方のタンパク質の存在を評価して、目的のタンパク質間の相互作用を確認します。

細胞ライセートとSTRPビーズスラリー混合物を2時間インキュベートした後、摂氏4度で2分間、1,1500倍gでスピンダウンします。上清を「STREP APフロースルー」として保存し、摂氏4度で保存します。

500マイクロリットルのSTREP AP洗浄バッファー1をビーズに加えます。ビーズとバッファー混合物を摂氏4度で5分間鳴動させ、摂氏4度で2分間1,500回gで遠心分離します。上清を廃棄し、500マイクロリットルのSTREP AP洗浄バッファー1で再度洗浄します。

3回目の洗浄後、ビーズ溶液を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して、タンパク質のバックグラウンドを減らします。STREP AP Wash Buffer 1 で 4 回洗浄します。スピン後、上清を取り除き、500マイクロリットルの洗浄バッファー2を加えます。

チューブを反転させてビーズを平衡化し、摂氏4度で2分間、1,500倍gでスピンダウンします。上清を捨てます。目的のタンパク質を50マイクロリットルのSTRP溶出バッファーで溶出します。摂氏 4 度で 800 RPM で 15 分間渦を起こします。ビーズを摂氏4度で1500回gで1分間回転させます。上清を回収します。この画分は「STREP AP溶出」サンプルに相当します。

ビーズ画分を摂氏4度で保存して、2回目の溶出を行います。銀染色および/またはウェスタンブロッティングのためにSTREP AP溶出液の10%をアリコートします。

その後のFLAG免疫沈降のための出発物質の量を増やすために、1番目と2番目のSTREP溶出液をプールして、FLAG溶出をより効率的に回収することができます。

この手順は、広口ピペットチップを使用して、適切な量のFLAGビーズ溶液を微量遠心チューブに移すことから始めます。1,500 g で 4 °C で 2 分間回転させます。上清を取り除き、500マイクロリットルのFLAG洗浄バッファーをビーズに加えます。

1,500 g で 4 °C で 2 分間回転させます。上清を廃棄し、FLAG洗浄バッファーで再度洗浄します。3回目の洗浄後、上清を取り除き、ビーズをFLAG洗浄バッファーに再懸濁し、最終体積はn×16マイクロリットル(nはサンプル数)に再浮遊します。

残りのSTREP AP溶出液に16マイクロリットルのFLAGビーズスラリーを加え、摂氏4度で一晩章動します。FLAGビーズスラリーとSTREP AP溶出を一晩インキュベートした後、FLAG免疫沈降を続行します。

FLAGビーズ懸濁液を1,500回gで4°Cで2分間回転させます。上清を「FLAG IPフロースルー」として保存し、摂氏4度で保存します。

500マイクロリットルのFLAG洗浄バッファーをビーズに加えます。摂氏4度で5分間章動し、摂氏4度で2分間1,500倍gで遠心分離します。上清を廃棄し、500マイクロリットルのFLAG洗浄バッファーで再度洗浄します。

3回目の洗浄後、プロテインビーズ溶液を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移してバックグラウンドを減らします。FLAG洗浄バッファーで4回目を洗浄します。最終スピンから上清を取り除き、FLAGペプチド1マイクロリットルあたり200ナノグラムを含む30マイクロリットルのFLAG洗浄バッファーをビーズに加えます。摂氏4度で800RPMで2時間渦を起こします。

2時間後、懸濁液を1,500回gで摂氏4度で2分間スピンダウンします。上清を採取し、「FLAG IP溶出液」として摂氏4度で保存します。