タンパク質間相互作用を研究するためのタンデムアフィニティー精製アッセイ

タンデムアフィニティー精製は、タンパク質複合体を細胞から単離してタンパク質間相互作用を研究するための逐次精製スキームです。

まず、目的のエピトープタグ付きタンパク質を発現する細胞培養を取ります。タンパク質は細胞内で複合体を形成します。複合体内のタンパク質の1つは溶連菌タグを含み、もう1つはFLAGタグで標識されています。これらは、小さな合成ペプチド配列ベースのアフィニティータグです。

培地を取り除き、界面活性剤溶液を加えて細胞を溶解します。遠心分離機で細胞破片を除去します。標的タンパク質複合体と他の細胞タンパク質を含む上清を収集します。

連鎖球菌ビーズ(ストレプトアビジンでコーティングされたアガロースビーズ)を加え、インキュベートします。タンパク質複合体の連鎖球菌タグはストレプトアビジンに結合します。遠心分離してタンパク質複合体に結合したビーズを収集します。洗浄して汚染された細胞タンパク質を除去します。

スト

レプトアビジンに競合的に結合することによりタンパク質複合体を置換するデスチオビオチン(ビオチン誘導体)を含む溶出バッファーを追加します。溶出したタンパク質複合体を含む上清を得るために遠心分離します。

FLAGビーズ(抗FLAG抗体でコーティングされたアガロースビーズ)を加えてインキュベートします。タンパク質複合体のFLAGタグは抗体に結合します。遠心分離してタンパク質複合体に結合したビーズを収集します。

遊離FLAGペプチドを含む溶出バッファーを添加します。ペプチドは抗体に競合的に結合し、結合したタンパク質複合体を置換します。精製されたタンパク質複合体を溶出するために遠心分離します。

溶出中の両方のタンパク質の存在を評価して、目的のタンパク質間の相互作用を確認します。

細胞ライセートとSTRPビーズスラリー混合物を2時間インキュベートした後、摂氏4度で2分間、1,1500倍gでスピンダウンします。上清を「STREP APフロースルー」として保存し、摂氏4度で保存します。

500マイクロリットルのSTREP AP洗浄バッファー1をビーズに加えます。ビーズとバッファー混合物を摂氏4度で5分間鳴動させ、摂氏4度で2分間1,500回gで遠心分離します。上清を廃棄し、500マイクロリットルのSTREP AP洗浄バッファー1で再度洗浄します。

3回目の洗浄後、ビーズ溶液を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して、タンパク質のバックグラウンドを減らします。STREP AP Wash Buffer 1 で 4 回洗浄します。スピン後、上清を取り除き、500マイクロリットルの洗浄バッファー2を加えます。

チューブを反転させてビーズを平衡化し、摂氏4度で2分間、1,500倍gでスピンダウンします。上清を捨てます。目的のタンパク質を50マイクロリットルのSTRP溶出