原子レベルのタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴

核磁気共鳴(NMR)分光法により、原子レベルのタンパク質間相互作用の検出が可能になります。

球状タンパク質とらせん状タンパク質の間の相互作用を研究するには、精製された野生型または変異球状タンパク質を窒素同位体である¹⁵Nで標識します。NMRチューブで、標識された球状タンパク質と標識されていないらせん状タンパク質をNMR標準を含む溶媒に混合します。チューブをNMR分光計に挿入します。

分光器磁石は強力な磁場を生成し、¹⁵個のN標識球状タンパク質核を磁場に平行に整列させます。高周波(RF)パルスは、¹⁵個のN原子核を励起して、磁場に反平行に整列させます。

2つの状態間の^15Nの原子核の遷移に必要なパルス周波数は、共振周波数を定義します。¹⁵N共鳴周波数をNMR標準に正規化すると、¹⁵Nの化学シフトが測定されます。

磁場は、¹⁵Nに結合した¹つのH原子核を磁場に平行に整列するように調整されます。RFパルスが調整され、¹H化学シフトが記録されます。

タンパク質相互作用中に、相互作用するアミノ酸残基を取り巻く化学環境が変化し、^{15 N-1}H化学結合とそれに対応する化学シフトが変化します。^{15 N-1}H NMRスペクトルをプロットします。

らせん状タンパク質がない場合、野生型球状タンパク質は十分に分解されたスペクトルピークを示します。らせん型と野生型球状タンパク質が相互作用すると、スペクトルピークが減少します。対照的に、らせん状タンパク質を変異球状タンパク質とインキュベートすると、スペクトルピークが再び現れ、それらの間の相互作用がないことを示します。

イジェクトコマンド「ej」でエアフローをオンにします。これにより、サンプルが磁石から引き上げられます。次に、開口部の磁石の上にあるスピナー内にサンプルを置きます。コマンド「ij」で挿入します。サンプルが磁石の内部に沈むまで待ってから続行します。

「edc」コマンドを使用して新しいデータセットを作成し、実験「ZGPR」を選択して標準陽子NMRパラメータをロードします。名前、実験番号、および処理済みデータ フォルダー番号のフィールドに入力します。

「溶媒の設定」フィールドで溶媒を選択し、「'getprosol'の実行」をクリックして、標準プローブヘッドと溶媒依存パラメータを読み取ります。「ロック」コマンドを使用してサンプルを重水素化溶媒にロックし、スイープが終了してロックが完了するまで待ちます。

自動チューニングコマンド「atma」を使用してサンプルをチューニングすることにより、磁石の共振周波数を補正します。自動調整が完了するまで、ぐらつき曲線を監視します。

「TOPSHIM」を使用して磁場をシムします。シミングは、サンプルの周囲の均一性を達成するために磁場を調整します。同じサンプルまたは類似のサンプルを使用する場合は、コマン