ファージディスプレイを用いて標的タンパク質に高い親和性を持つタンパク質を選択

ファージの表示を開始するには、ターゲットタンパク質でコーティングされたマルチウェルプレートのウェルにファージライブラリーを追加します。ファージライブラリには遺伝子操作されたファージが含まれており、それぞれが表面のコートタンパク質に融合した個々のタンパク質変異体を示します。インキュベートして、ファージと標的タンパク質が相互作用できるようにします。

的タンパク質親和性が高いタンパク質を持つファージは、標的タンパク質に結合します。緩衝液で洗浄し、結合していないファージを除去します。酸性溶液を加えて、ファージと標的タンパク質の相互作用を破壊し、ファージを溶液中に放出します。バッファーを使用して溶液のpHを中和し、ファージの安定性を維持します。

ファージを新しいチューブに移します。タンパク質を含むブロッキング溶液でインキュベートし、非特異的相互作用を防ぎます。

ファージを活発に分裂する大腸菌懸濁液に移し、細菌に感染し、ファージ複製サイクルを開始します。細菌に感染するヘルパーファージを補給し、子孫ファージをパッケージ化するために必要なコートタンパク質を提供します。懸濁液を選択培地に移し、ファージに感染した細菌の増殖を可能にします。

子孫ファージは最終的に培地に放出されます。遠心機。ファージを含む上清を採取します。沈殿溶液を加え、ファージ粒子を濃縮します。遠心機。ファージペレットを緩衝液に再懸濁し、均質な懸濁液を得る。

その後のファージ選択ラウンドを実行します。ファージと標的タンパク質の結合、バッファー洗浄の厳密性を高めた溶出、増幅および遠心分離のステップを繰り返し、その結果、標的タンパク質に対して高い親和性を持つタンパク質を示すファージプールが濃縮されます。

氷上でファージライブラリを解凍します。次に、PBS中のライブラリ多様性の100倍に希釈します。ポリエチレングリコール/塩化ナトリウム溶液を希釈したライブラリー容量の1/5で加え、溶液を氷上で30分間インキュベートします。次に、溶液を摂氏4度で30分間、11,000倍gで遠心分離します。上清を捨て、さらに2分間遠心分離して残りの上清を引き下げ、ファージペレットを濃縮します。

ファージペレットを、分析する標的タンパク質ごとに1ミリリットルのPBTバッファーに穏やかに再懸濁します(通常は合計4つ)。100マイクロリットルのファージライブラリーを、コントロールプレートの各コーティングウェルに加えます。室温で300 RPMの軌道振とうで1時間インキュベートします。

PBバッファーをターゲットプレートからシンクに捨て、ペーパータオルでプレートを乾かします。コントロールプレート内のファージライブラリーの100マイクロリットルすべてを、ターゲットプレートの各コーティングウェルに移します。室温で300 RPMの軌道振とうで1時間インキュベートします。

次に、プレートからファージライブラリを取り出し、コーティングされたウェルをPTバッファーで4回洗浄します。プレートを裏返し、ペーパータオルを軽くたたいて、バッファーの最後の一滴を取り除きます。100マイクロリットルの0.1モル塩酸をコーティングされた各ウェルに加えて、ファージを溶出します。プレートを室温で5分間インキュベートし、300 RPMの軌道振とうします。

その後、12.5マイクロリットルのpH 11 1モルトリス塩酸塩を各コーティングウェルに加えることにより、pHを中和します。8つのウェルすべてから溶出したファージを1つの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。移送中に上下にピペットで移動して溶液を均一にし、ウェルからすべての液体を吸引します。溶出したファージに10%BSAを加えて、最終濃度を1%にします。

微量遠心チューブを摂氏4度で保管します。これはラウンド1の出力です。寒天プレートから単離された大腸菌コロニーを5ミリリットルの2YT/テトラサイクリン種子培養物に接種することにより、次の選択ラウンドのためにファージインプットを培養するための種子培養を準備します。

氏37度で200 RPMの軌道振とうで一晩インキュベートします。ラウンド2および3チューブ内の標的タンパク質を適量のPBSで希釈します。ラウンド2および3チューブの内容物の半分を取り、次のラウンドのために96ウェル結合プレートに標的タンパク質ごとに4つのウェルをコーティングします。

次に、ラウンド1出力の半分を使用して、3ミリリットルの中間対数相細胞を接種します。摂氏37度で200RPMの軌道振とうで30分間インキュベートします。M13KO7ヘルパーファージを1ミリリットルあたり100億pfuの最終濃度に添加します。摂氏37度で200RPMの軌道振とうで1時間インキュベートします。

1時間後、培養物3ミリリットル全体を30ミリリットルの2YT /カルベニシリン/カナマイシン溶液に移します。摂氏37度で一晩成長し、200RPMの軌道振動で成長します。