二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

活性

型では、グアニンヌクレオチド結合タンパク質である原形質膜関連Rasモノマーは、Ras結合ドメインを介してRasに結合する不活性プロテインキナーゼであるRafを動員します。

この結合により、下流のシグナル伝達プロセスを引き起こす機能的なRas-Raf複合体が生成されます。

細胞内Ras-Raf相互作用を視覚化するには、遺伝子操作された細胞を十分にチャンバー化されたスライドに懸濁することから始めます。これらの細胞は2つの非蛍光融合タンパク質を発現します - 1つはN末端を介して光活性化可能な蛍光色素の半分に結合したRasで構成され、もう1つはC末端で同じ蛍光色素の残りの半分に融合したRafです。

細胞内では、Ras含有融合タンパク質が原形質膜にドッキングし、Raf含有融合タンパク質と相互作用し、蛍光タンパク質の断片を完全な光活性化可能な蛍光色素に再構成します。RasとRafの結合がないため、2つの蛍光色素の半分が分離されたままになります。

スライドに固定試薬を追加します。固定分子はタンパク質と架橋を形成し、タンパク質複合体を安定化します。

固定試薬を取り出し、イメージングバッファーを追加します。スライドを光活性化局在顕微鏡用にセットされた蛍光顕微鏡、PALMの下に置きます。高強度レーザーで細胞を照らし、蛍光分子の小さなサブセットを活性化します。

ナノサイズの単一蛍光色素タグ付きRas-Raf複合体によって生成されるランダムに発生する蛍光を、高分解能蛍光ドットとして表示します。

イメージング用のサンプルを調製するには、8ウェルガラス底チャンバースライドのウェルあたり約5.5 x 10⁴個の安定発現細胞を、350マイクロリットルのフェノールレッドフリーDMEMにプレートします。グルタルアルデヒドを含む新鮮なパラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、固定液をPBSまたはイメージングバッファーに置き換えた後、100ナノメートルの金粒子をボルテックスし、イメージング中のステージドリフトを追跡するためにウェルあたり35マイクロリットルを追加します。

顕微鏡に近づき、405 ナノメートルと 561 ナノメートルのレーザーをパワーアップします。この時点でシャッターを閉めたまま、561ナノメートルのダイクロイックミラーとノッチフィルターが所定の位置にあることを確認します。画像取得ソフトウェアを開きます。

EMCCDカメラの電源を入れて冷やし、露光時間を100ミリ秒に、EMCCDゲインを適切な値に設定します。対物レンズに浸漬油を加え、サンプルを顕微鏡ステージに固定します。次に、明視野または561ナノメートルレーザーのいずれかを使用して、サンプルに焦点を合わせます。

Rasやその他の膜タンパク質をイメージングするには、開口数1.49の60倍アポクロマートTIRF対物レンズを使用