ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

DNA上の標的タンパク質の結合部位を特定するには、クロマチンの特定のDNA配列に架橋された標的タンパク質を含むオリゴデンドロサイト前駆細胞から始めます。

プロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーで細胞を処理します。溶解バッファーは細胞を溶解し、阻害剤はプロテアーゼを不活性化してタンパク質-クロマチン複合体の完全性

を維持します。

内容物を超音波処理して、複合体をより小さなクロマチン断片にせん断し、一部は標的タンパク質を保持します。

遠

心分離して細胞成分をペレット化し、クロマチン断片を含む上清を新鮮なチューブに移します。クロマチン断片上の標的タンパク質に特異的に結合する抗標的抗体とインキュベートします。

プレバウンド抗体のFc領域に結合するプロテインAコーティングされた磁気ビーズをチューブに補充します。磁場を印加して、クロマチン断片と複合体を形成した抗体結合標的タンパク質を選択的に沈殿させます。

ビーズ複合体を高塩含有溶出バッファーで処理して、タンパク質とクロマチンの相互作用を破壊し、関連タンパク質のない裸のDNAを放出します。

有機溶媒を使用してDNAを抽出します。増幅バッファーを加え、ポリメラーゼ連鎖反応を実行してDNA断片を増幅します。増幅後、DNA配列を分析します。

増幅された産物の配列を細胞のゲノムDNA配列と比較します。フラグメントとゲノムDNAの間に配列が一致する領域を見つけ、タンパク質結合部位と相関させます。

血球計算盤でカウントした後、ChIP反応のために1ミリリットルのOPC細胞培養培地に精製したOPCを20,000個加えます。次に、27マイクロリットルの36.5%ホルムアルデヒドを室温で10分間加えます。これにより、セルが修正されます。

10分後、固定細胞に50マイクロリットルの2.5モルグリシンを室温で5分間加えます。グリシンを添加すると、DNA-タンパク質の架橋が停止します。次に、架橋細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む1ミリリットルのHBSSバッファーで洗浄します。次に、予冷された遠心分離機で細胞を摂氏4度で300倍gで遠心分離します。

精製したOPCを架橋した後、架橋細胞を氷冷のHBSS溶液で洗浄し、残りのChIPステップを4度で実行する必要があります。そうしないと、抗体はゲノムDNAを適切に沈殿させることができません。

次に、25マイクロリットルの完全溶解バッファーを細胞ペレットに加え、氷上で5分間放置します。次に、75マイクロリットルの氷冷HBSSバッファーをプロテアーゼ阻害剤カクテルでピペットで移します。次に、30秒のオンと30秒のオフプログラムの5サイクルで予冷された超音波処理システムで細胞溶解物のクロマチンをせん断します。

クロマチンがせん断されたら、細胞ライセートを摂氏4度で10分間14,000倍gで遠心分離します。遠心