転写因子-DNA結合親和性を決定するための蛍光異方性

転写因子TFは、遺伝子の特定のDNA領域に結合し、転写を調節するタンパク質です。

蛍光異方性によってTF-DNA相互作用を測定するには、マルチウェルプレートを取ります。TF結合部位と高濃度のTF分子を含む既知の濃度の蛍光色素タグ付き参照DNAを含む緩衝溶液と混合した溶融ゲルをウェルに加え、インキュベートします。

標識された参照DNAがゲル中に分布するため、TF分子濃度が高いほど、すべてのDNA分子がTFに結合します。シングルポイント変異を持つ非標識競合DNAを含む緩衝液を追加します。

高性能蛍光異方性顕微鏡を使用してプレートのゲルを分析します。

偏光は、分子タンブリングによって方向転換され、多方向の脱偏光を放出する参照DNA結合蛍光色素を励起します。

TFに結合すると、参照DNA結合蛍光色素の分子量が増加し、転がりが遅くなり、FAを増加させる偏光を放

出します。

標識されていない競合DNAは、時間の経過とともにゲルマトリックス全体に拡散し、高濃度から低濃度の勾配を形成します。標識されていない競合DNA濃度が高いほど、標識参照DNAが置換され、TFに結合します。放出された標識参照オリゴマーはより速く転がり、FAを減少させます。

蛍光色素のFAと競合DNAの濃度勾配を経時的にプロットします。

96ウェルプレートの滴定およびキャリブレーションウェルを調製するには、2つのゲルストックアリコートを摂氏75度のインキュベーターシェーカーに移します。

各

滴定ウェルについて、1.4ナノモルの参照DNA、最終濃度20〜60ナノモルの転写因子タンパク質、0.2ミリモルDTT、および結合バッファーを240マイクロリットルの溶融ゲルに加えます。

チューブを反転させて振ってよく混ぜます。次に、96ウェルプレートの指定された滴定ウェルに、DNA含有ゲルのウェルあたり200マイクロリットルをゆっくりとピペットでかけます。キャリブレーションウェルごとに、溶融ゲル240マイクロリットルに5ナノモルのナイルブルー色素を加えます。気泡を避けて、200マイクロリットルの色素含有ゲル溶液を96ウェルプレートの5〜6ウェルにゆっくりとピペットで入れます。

ゲルを完全に水平面に置き、室温で10分間、摂氏4度でさらに10分間インキュベートします。マルチウェルプレートリーダーを使用して、プレートのさまざまなウェルのゲル高さレベルの均一性をチェックします。

競合他社のDNA溶液を調製するには、まず、標識された参照DNA、タンパク質、および3倍濃縮結合バッファーを組み合わせます。次に、20マイクロリットルの溶液を、アニールされた競合他社のDNA溶液のそれぞれ40マイクロリットルと混合します。

キャリブレーションウェルごとに、アニーリングされた競合他社のDNA溶液の1つと、15ミリモルのナイルブルー色素溶液を含む3