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RNA結合タンパク質(RBP)は、mRNAの翻訳開始領域(TIR)に結合し、翻訳を抑制することにより、転写後調節因子として機能します。
レポーター遺伝子の翻訳抑制を介したRNA-RBP相互作用を研究するには、結合部位とRBPプラスミドの2つのプラスミドを含む細菌細胞培養物を取ります。
結合部位プラスミドは蛍光レポーター遺伝子をコードします。転写時に、得られたmRNAのTIRは、RBPによって認識される配列を持つリボソーム結合部位とヘアピン構造を含みます。
リボソームはmRNAの結合部位に結合し、ヘアピン構造を不安定にし、mRNAの翻訳と蛍光レポータータンパク質の形成につながります。RBPプラスミドは、異なる蛍光タンパク質に融合したキメラRBPを発現します。誘導性プロモーターはキメラタンパク質の発現を制御します。
プロモーターに結合する転写因子を活性化し、キメラタンパク質の発現を誘導する誘導剤を添加します。キメラタンパク質のRBPはヘアピン構造に結合します。これにより、リボソームがmRNAに結合するのをブロックし、レポータータンパク質の翻訳を阻害します。
誘導剤濃度が増加すると、RBP産生が増加し、その結果、mRNAへのリボソーム結合の競合阻害がより強くなります。
キメラタンパク質とレポータータンパク質からのさまざまな蛍光シグナルを測定します。シグナルをプロットし、用量反応曲線を取得します。
誘導剤を介したRBP産生の増加により、翻訳抑制によりレポータータンパク質濃度が低下し、RNA-RBP相互作用が確認されます。
調製したプラスミドを、すでにRBP-mCeruleanプラスミドを含む化学的にコンピテントな細菌細胞に変換します。時間を節約するために、関連する抗生物質を含むLuria-Bertani寒天培地を含む8レーンプレートに8チャンネルピペッターを使用して細胞をプレートします。コロニーは摂氏37度で16時間で現れるはずです。
二重形質転換体ごとに単一のコロニーを選択し、適切な抗生物質を含む1.5ミリリットルのLBを含む48ウェルプレートに移します。摂氏37度で250RPMで振とうしながら18時間かけて細胞を増殖させます。一晩のグリセロールストックを摂氏-80度で96ウェルプレートに保管します。
朝、96ウェルプレートで180マイクロリットルのセミポア培地(SPM)を温めるようにロボットをプログラムします。ロボットをプログラムして、誘導プレートを準備します。
クリーンな96ウェルプレートで、95%BAと5%LBからなるSPMでウェルを調製します。ウェルの数は、誘導剤濃度の所望の数に対応します。C4-HSLを、最も高い誘導剤濃度を含む誘導剤プレートのウェルに加えます。
次に、最高濃度のウェルのそれぞれから培地を0〜218ナノモルの範囲の23の低濃度に連続的に希釈するようにロボットをプログラムします。各誘導剤希釈量は、すべての株に十分でなければなりません。
一晩の菌株を希釈するには、48ウェルプレートで20マイクロリットルの細菌と180マイクロリットルのSPMを混合して、10倍に希釈するようにロボットをプログラムします。次に、希釈した溶液から20マイクロリットルを蛍光測定に適した予め調製されたひずみプレートに取り、再び10倍に希釈します。
次に、最終濃度に従って、希釈した株を使用して、誘導プレートから希釈した菌株を持つ96ウェルプレートに希釈したインデューサーを追加するようにロボットをプログラムします。96ウェルプレートを摂氏37度で6時間振とうします。その間、595ナノメートルでの光学密度またはOD、およびプレートリーダーを介してmCherryおよびmCerulean蛍光を30分ごとに測定します。