標的遺伝子の翻訳制御を研究するためのレポーター遺伝子抑制アッセイ

RNA結合タンパク質(RBP)は、mRNAの翻訳開始領域(TIR)に結合し、翻訳を抑制することにより、転写後調節因子として機能します。

レポーター遺伝子の翻訳抑制を介したRNA-RBP相互作用を研究するには、結合部位とRBPプラスミドの2つのプラスミドを含む細菌細胞培養物を取ります。

結合部位プラスミドは蛍光レポーター遺伝子をコードします。転写時に、得られたmRNAのTIRは、RBPによって認識される配列を持つリボソーム結合部位とヘアピン構造を含みます。

リボソームはmRNAの結合部位に結合し、ヘアピン構造を不安定にし、mRNAの翻訳と蛍光レポータータンパク質の形成につながります。RBPプラスミドは、異なる蛍光タンパク質に融合したキメラRBPを発現します。誘導性プロモーターはキメラタンパク質の発現を制御します。

プロ

モーターに結合する転写因子を活性化し、キメラタンパク質の発現を誘導する誘導剤を添加します。キメラタンパク質のRBPはヘアピン構造に結合します。これにより、リボソームがmRNAに結合するのをブロックし、レポータータンパク質の翻訳を阻害します。

誘導剤濃度が増加すると、RBP産生が増加し、その結果、mRNAへのリボソーム結合の競合阻害がより強くなります。

キメラタンパク質とレポータータンパク質からのさまざまな蛍光シグナルを測定します。シグナルをプロットし、用量反応曲線を取得します。

誘導剤を介したRBP産生の増加により、翻訳抑制によりレポータータンパク質濃度が低下し、RNA-RBP相互作用が確認されます。

調製したプラスミドを、すでにRBP-mCeruleanプラスミドを含む化学的にコンピテントな細菌細胞に変換します。時間を節約するために、関連する抗生物質を含むLuria-Bertani寒天培地を含む8レーンプレートに8チャンネルピペッターを使用して細胞をプレートします。コロニーは摂氏37度で16時間で現れるはずです。

二重形質転換体ごとに単一のコロニーを選択し、適切な抗生物質を含む1.5ミリリットルのLBを含む48ウェルプレートに移します。摂氏37度で250RPMで振とうしながら18時間かけて細胞を増殖させます。一晩のグリセロールストックを摂氏-80度で96ウェルプレートに保管します。

朝、96ウェルプレートで180マイクロリットルのセミポア培地(SPM)を温めるようにロボットをプログラムします。ロボットをプログラムして、誘導プレートを準備します。

クリーンな96ウェルプレートで、95%BAと5%LBからなるSPMでウェルを調製します。ウェルの数は、誘導剤濃度の所望の数に対応します。C4-HSLを、最も高い誘導剤濃度を含む誘導剤プレートのウェルに加えます。

次に、最高濃度のウェルのそれぞれから培地を0〜218ナノモルの範囲の23の低濃度に連続的に希