ヘテロメアタンパク質複合体-DNA相互作用を検出するための改変酵母-Oneハイブリッドアッセイ

修飾酵母ワンハイブリッドアッセイを使用して、複数のタンパク質が関与するヘテロマータンパク質複合体と標的DNAの間の相互作用を検出するには、活発に増殖し、形質転換された酵母細胞培養物の所望の濃度を含むマルチウェルプレートを取ります。

これらの細胞は、GAL-4プロモーターによって駆動されるレポーター β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の上流に特定のDNA配列を含んでいますが、内因性のGAL-4転写因子タンパク質は欠けています。細胞は、GAL-4活性化ドメインに融合した標的タンパク質と、GAL-4DNA結合ドメインを欠く別のタンパク質を発現します。

これらのタンパク質が相互作用すると、複合体を形成し、標的タンパク質がレポーター遺伝子のプロモーター領域の上流のDNA配列に結合できるようになります。GAL-4活性化ドメインは、レポーター β-ガラクトシダーゼ酵素の発現を活性化します。

遠心機。細胞を適切なバッファーに再懸濁します。細胞を凍結融解して溶解し、β-ガラクトシダーゼを放出します。ベータ-メルカプトエタノールとβ-ガラクトシダーゼ基質含有バッファーを加えます。

ベータ-メルカプトエタノールはβ-ガラクトシダーゼ酵素を安定化します。β-ガラクトシダーゼはβ-ガラクトシダーゼ基質を加水分解し、黄色の発色原を形成します。

炭酸ナトリウム溶液を加えてβ-ガラクトシダーゼを変性させ、反応を停止します。遠心機。黄色の発色原を含む上清をマルチウェルプレートに移します。プレートリーダーを使用して、適切な波長で溶液の光学密度を測定し、β-ガラクトシダーゼ活性を計算します。

β-ガラクトシダーゼ活性が高いほど、タンパク質と標的DNA配列との間に正の相互作用があることを示し、β-ガラクトシダーゼの発現につながります。

培養物を再懸濁し、各ウェルから125マイクロリットルを分光光度計プレートに移します。600ナノメートルで光学密度を測定し、0.3〜0.6であることを確認します。ディープウェルブロック内の残りの細胞を3,000倍g、摂氏21度で10分間遠心分離します。反転して上清を取り除きます。

各ウェルに200マイクロリットルのZバッファーを加え、ボルテックスします。3,000倍g、摂氏21度で5分間遠心分離します。反転して上清を取り除きます。各ウェルに20マイクロリットルのZバッファーを加え、ボルテックスします。凍結融解サイクルに耐性のあるシーリングホイルでプレートを覆います。

ヒュームフードで、摂氏42度のウォーターバスで液体窒素を使用して凍結融解を4サイクル実行します。200マイクロリットルの新たに調製したZバッファー/ベータ-メルカプトエタノール/ONPG溶液を各ウェルに加えます。摂氏30度で17〜24時間、または色がつくまでインキュベートします。色が発達したことを確認してください。

反応を停止するために、各ウェルに110マイクロリットルの1モル炭酸ナトリウムを加えます。時間を記録し、プレートをボルテックスします。3,000倍g、摂氏21度で10分間遠心分離します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから125マイクロリットルの上清を分光光度計プレートに移します。420ナノメートルで光学密度を測定します。