0 閲覧数 • 4:10 分 • July 8th, 2025
RNAヘリカーゼ活性を持つタンパク質は、RNA二本鎖内の個々のRNA分子を巻き戻して分離するのに役立ちます。
タンパク質のヘリカーゼ活性を決定するには、ビオチン標識RNA二本鎖と5'オーバーハング、ATP、およびRNAトラップ(二本鎖のビオチン化鎖を補完する非標識鎖)の混合物を含むチューブを採取します。
ヘリカーゼ活性を持つタンパク質を各チューブに加え、異なる期間インキュベートします。タンパク質は二本鎖の5'オーバーハングに結合します。
ATP 分子を使用して、2 本の二本鎖間の水素結合を切断し、その結果、二本鎖が巻き戻されてビオチン化された一本鎖 RNA が放出されます。RNAトラップはビオチン標識鎖と相互作用し、分離された鎖との再アニーリングを防ぎます。
ターミネーションバッファーを使用して反応を終了します。
天然ポリアクリルアミドゲルの異なるウェルにサンプルをロードします。電気泳動を実行します。低分子量の一本鎖RNAは、高分子量二本鎖よりも速く移動します。この移動度の変化により、2つの異なるバンドが生成されます。
ナイロンメンブレン上でゲルをブロットし、RNAをメンブレンに移します。ブロッティング後、メンブレンをUV光にさらし、RNAをメンブレンに架橋します。
二本鎖および一本鎖のビオチンと相互作用する化学発光酵素結合ストレプトアビジンを追加します。化学発光基質を使用して化学発光製品を製造します。
イメージングすると、低分子量バンドの強度は時間の経過とともに増加し、標的タンパク質のヘリカーゼ活性と相関します。
MOV10ヘリカーゼ活性アッセイでは、原稿の指示に従って試薬を混合し、最終反応量20マイクロリットルになるように水を加えます。反応を摂氏37度で10分、30分、60分間インキュベートし、5X Stop Bufferを加えて反応を停止します。次に、20%天然ポリアクリルアミドゲルを調製し、各サンプルを20〜25マイクロリットルを各ウェルにロードします。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルの下部四分の一に移動するまで、氷浴上でゲルを100ボルトで実行します。
アクリルアミドは有害で有毒です。適切な個人用保護具を着用して取り扱うことが重要です。
ゲルプレートを分解し、ローディングウェルと未使用のレーンを取り外してゲルをトリミングします。ゲルを0.5X TBEバッファーに入れます。ろ紙とナイロン膜をゲルのサイズにカットし、紙と膜を事前に濡らし、スタックを組み立てて転写します。
サンプルをゲルから膜に、90ミリアンペアの半乾燥電気泳動装置で20分間移します。次に、メンブレンを120ミリジュール/センチメートル平方で45〜60秒間照射することにより、サンプルを架橋します。
化学発光検出の場合は、まず20ミリリットルのブロッキングバッファーをメンブレンに加え、穏やかに振とうしながら15〜30分間インキュベートします。ブロッキングバッファーを慎重に取り除き、コンジュゲートブロッキングバッファーと交換します。メンブレンを再び15分間インキュベートします。
メンブレンを4回洗浄し、1回5分間振とうします。次に、30ミリリットルの基質平衡バッファーをメンブレンに加え、20〜25RPMで振とうしながら5分間インキュベートします。
膜の表面全体を基質作業溶液で覆い、5分間インキュベートします。インキュベーション後、化学発光イメージングシステムでメンブレンを1〜3秒間スキャンします。