免疫蛍光法によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

放射線誘発性DNA二本鎖切断(DSB)は、損傷部位でDNA修復タンパク質の動員を開始し、DNA修復を活性化します。

間接免疫蛍光法を使用してDSB部位のDNA修復タンパク質γH2AXおよび53BP1を検出するには、上皮細胞を含むカバーガラスを取ります。細胞のサブセットを照射します。インキュベートし、対照の非照射細胞と照射細胞を特定の時間増殖させます。

細胞核を抽出するために緩衝液で処理します。細胞核を固定して形態を維持します。ブロッキング溶液で処理して、非特異的一次抗体の結合を最小限に抑えます。

2つのDNA修復タンパク質を標的とする一次抗体を追加します。抗体はそれぞれのタンパク質に結合します。

それぞれ赤色および緑色の蛍光色素でタグ付けされた二次抗体とインキュベートします。各一次抗体に特異的な二次抗体は、その標的に結合します。スライドガラスにDAPIを含む封入剤を追加します。カバーガラスを取り付けてイメージングします。

DAPI(DNA結合色素)は、二本鎖DNAのATに富む小さな溝に結合し、核を対比染色します。蛍光顕微鏡を使用して細胞核を視覚化します。

されていない細胞核と比較して、照射された細胞核は時間の経過とともに減少する複数のγH2AX病巣を示し、長期間増殖した細胞では進行性のDNA修復を示しています。

赤と緑の蛍光シグナルが重なり合うと黄色に見え、照射後のDSB部位でのγH2AXと53BP1の共局在を示しています。

、18 mmの丸いガラスカバーガラスを備えた12ウェルプレートの各ウェルで40,000個のHeLa細胞を80%のコンフルエントまで増殖させます。細胞を4グレイガンマ線照射にさらした後、1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。次に、PBSを完全に除去し、各ウェルに200マイクロリットルのNEBを追加します。細胞を室温で2分間インキュベートし、NEBを除去します。

インキュベーション時間は細胞株によって異なりますが、通常は 2 分を超えてはならないことに注意してください。細胞を1ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、PBSを完全に除去し、細胞固定のために各ウェルに200マイクロリットルの4%PFAを加えます。

細胞を摂氏4度で10分間インキュベートし、次にPFAを除去し、各ウェルに1ミリリットルのPBSを加えます。PBSを完全に除去し、次に、各ウェルに200マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、細胞を室温で2時間、または摂氏4度で16〜18時間インキュベートします。

一次抗体を希釈バッファーで希釈し、よく混合されるまでボルテックスします。湿度ボックスにパラフィルムを接着し、10マイクロリットルの一次抗体を1滴加えます。ウェルからのカバーガラスの片方の端を液滴に合わせ、パラフィルムの上にゆっくりと下げて液体を広げます。カバーガラスを室温で2時間インキュベートします。

インキュベーション後、カバーガラスをPBSで1回洗浄ごとに1分間3回洗浄します。二次抗体を希釈バッファーで希釈し、よく混合されるまでボルテックスします。前述のように、各カバーガラスに10マイクロリットルの二次抗体を塗布し、光から保護した状態で室温で2時間インキュベートします。

カバーガラスをPBSで3回、水で1回、1回洗浄するたびに1分間洗浄します。次に、DAPIを含むグリセロールベースの封入媒体を使用してスライドガラスにマウントします。カバーガラスを透明なマニキュアで密封し、20分間乾燥させます。60X対物レンズに浸漬油を一滴垂らし、DAPIを使用して接眼レンズを通して核の位置を特定します。

XYZ画像取得の場合は、取得ソフトウェアを開き、「スキャナタイプ」を「ガルバノ」、「スキャナモード」を「ラウンドトリップ」、「512×512」の画像サイズに設定します。PMT パネルで、モードを VBM、平均をフレーム、シーケンシャルスキャンをラインに設定します。次に、染料検出器と熱検出器を設定します。チャンネル1をDAPIとSD1に、チャンネル2をAlexa Fluor 488とHSD3に、チャンネル3をAlexa Fluor 647とHSD4に設定します。「Z」で「ON」を選択します。

ライブ画像を調整するには、ライブウィンドウのライブボタンを押してフォーカスを調整します。次に、「PMT ツール」ウィンドウを使用して、レーザー強度、感度、ゲイン、オフセットを設定します。Zスタックで、開始から終了と15スライスを選択します。画像を保存するフォルダを選択し、LSMスタートボタンを押すと取得が開始されます。終了したら、Series Doneボタンを押して画像取得を完了します。