溶液中のタンパク質-脂質相互作用を研究するためのマイクロスケール熱泳動

タンパク質と脂質分子との相互作用を研究するには、2本の毛細管から始めます。両方のチューブに蛍光色素標識された試験タンパク質を、一方に標識されていない脂質分子を加えます。これらのキャピラリーをアレイに配置し、マイクロスケールの熱泳動装置内に配置します。

タンパク質を含む毛細管に集束赤外光を照射し、溶液中に拡散する焦点に温度上昇を発生させ、蛍光標識タンパク質を含む狭い領域内に温度勾配を生成します。

蛍光検出器は、レーザーが焦点を合わせている毛細管の同じ場所から蛍光シグナルを収集します。プロセッサはシグナルを変換し、時間の関数として相対蛍光のプロットを生成します。

温度勾配では、標識されたタンパク質は高温領域から低温領域に移動し始め、温度依存性移動の現象である熱泳動を示します。

熱泳動により、蛍光強度は時間の経過とともに徐々に低下し、標識タンパク質が平衡に達する定常状態に達します。

タンパク質と脂質の混合物を含む毛細血管を照射し、温度勾配を作成します。

熱泳動中、移動する標識タンパク質は脂質分子と相互作用し、より高い分子量の脂質-タンパク質複合体を形成します。これは彼らの動きの遅れにつながります。

この異なる移動により蛍光がシフトし、タンパク質と脂質の相互作用が成功したことが確認されます。

解析を開始する前に、MSTデバイスの背面にある電源スイッチをオンにし、制御ソフトウェアを開きます。コンピュータがデバイスに接続され、「接続済み」状態であることを確認し、MST Beforeを3秒、MSTを30秒、Fluorescence Recoveryを1秒後に設定します。

各

キャピラリーチューブについて、ターゲットリガンドの名前、リガンド分析物の名前、ターゲットの濃度、およびオートフィル滴定比を使用して最高滴定濃度を入力します。MST検出力の範囲を選択し、各検出力の値を入力して、最も堅牢な結合適合をテストします。

標識MSTサンプルを調製するには、Vam7-オクタヒスチジン溶液を200ナノモル濃度に希釈し、NTA-Atto 647色素をPBS中で100ナノモル濃度に希釈します。Vam7-オクタヒスチジンとNTA-Atto 647色素を1対1の体積比で混合し、混合物を光から保護した室温で30分間放置します。インキュベーションの最後に、色素とタンパク質の混合物を遠心分離し、溶液を摂氏4度で最大数時間保存してから使用します。次に、サンプルを準備します。色素をリガンドに取り、分析物を露出させます。

サンプルのマイクロスケール熱泳動の場合は、デバイスを開き、キャピラリーラックをスライドさせて引き出します。サンプルキャピラリーを位置1の最高濃度のラックにロードし、制御ソフトウェアで赤いチャンネルを選択します。次に、ラックを装置にロードします。次に、MSTパワーの範囲を選択し、キャップスキャン+MST測定を開始し、シフト応答を評価します。