0 閲覧数 • 2:43 分 • July 8th, 2025
細胞膜上のタンパク質とリン脂質の相互作用は、いくつかの細胞プロセスの調節にとって重要です。
定量的フローサイトメトリーを使用してin vitroで標的タンパク質とリン脂質の相互作用を検出するには、所望の濃度の細胞膜模倣物(ミクロンサイズの親油性色素標識リン脂質小胞)を含むチューブをバッファーに取ります。
溶液中に適切な濃度の異なる蛍光標識標的タンパク質を加えます。
懸濁液をフローサイトメーターに注入します。流体システムパラメータを低流量に設定して、タンパク質とリン脂質の相互作用に十分な時間を確保します。
蛍光標識タンパク質とリン脂質小胞が流路内で相互作用すると、小胞に結合したタンパク質の濃度が増加します。
これらの複合体は、適切な波長を提供する特定の蛍光チャネルからのレーザービームを通過すると、励起されます。複合体中のこれらの励起タンパク質とリン脂質小胞は、基底状態への緩和時にそれぞれの蛍光シグナルを放出し、適切な検出器によって捕捉されます。
タンパク質の高い平均蛍光強度の検出は、タンパク質がリン脂質小胞に結合していることを示しています。
Tyrodeのバッファーでリン脂質小胞を1マイクロモルの濃度と総容量250マイクロリットルに希釈することにより、速度論的結合実験を開始します。次に、蛍光標識凝固因子XまたはfX-fdを500ナノモルの濃度でリン脂質小胞と1:1の比率で混合して、総体積500マイクロリットルを得る。
500マイクロリットルの混合懸濁液を、チャンネルFL2の励起波長488ナノメートルの流速と幅42ナノメートルの585ナノメートルの発光フィルターでフローサイトメーターに直ちに注入します。
次に、633ナノメートルの励起と660ナノメートルの発光フィルターで、幅20のチャネルFL4の平均蛍光を測定します。結合の飽和が達成されたら、サンプルをTyrodeのバッファーで20倍に急速に希釈し、ベースラインの蛍光またはプラトーに達するまで解離を監視します。