タンパク質-脂質二重層相互作用を研究するための散逸性微小重量測定技術

散

逸マイクロ重量測定によってリン脂質結合タンパク質と脂質二重層の間の相互作用を研究するには、石英センサーでマイクロバランスを取ります。適切な電圧を印加すると、2 つの金属電極の間に挟まれた石英層が特定の周波数で振動します。

単一の脂質二重層からなる小さな単層小胞の懸濁液をセンサーに追加します。小胞はシリカでコーティングされた親水性表面に吸着し、センサーの質量を増加させ、それに比例して発振周波数を減少させます。

緩衝液で満たされた小胞は粘弾性層として機能し、散逸、つまり振動の減衰につながります。吸着された小胞は破裂し、封入された緩衝液を放出します。その結果、質量が減少すると、振動周波数が増加します。

破裂

した小胞は、生体膜を模倣して連続した二重層を形成します。二重層の剛性により、散逸が減少します。

カルシウムイオンを含むバッファーを、ターゲットタンパク質とともに追加します。カルシウムイオンはタンパク質に結合してそのコンフォメーションを変化させ、二重層の脂質分子への結合を可能にします。

タンパク質の結合によりセンサーの質量が増加し、周波数が低下します。二重層の構造的完全性は影響を受けず、散逸がわずかに増加するだけです。

キ

レート剤を加えてカルシウムイオンをキレート化し、タンパク質を二重層から解離させます。

結合タンパク質が存在しないと、振動の周波数と散逸が非タンパク質結合レベルに戻り、結合がカルシウムのみに依存し、二重層が無傷のままであることが確認されます。

ピン

セットを使用して、プラズマ洗浄されたセンサーを4つのフローチャンバーに慎重にドッキングします。漏れの原因となるチャンバーやチューブへの圧力やねじれを避けてください。クエン酸緩衝液でシステムをオープンフローモードで10分間洗い流します。

プログラムを起動します。周波数と散逸のベースラインが安定するまで、ソフトウェアを使用して、最初の基本音と倍音の周波数と散逸の変化の記録を開始します。

ベースラインが安定したら、クエン酸緩衝液にSUVサスペンションを塗布します。反応容器を使用して、1.5ミリリットルの死体積を除去します。次に、ループフローモードでシステムを閉じます。周波数散逸シフトをさらに10分間記録します。

SLBが安定したら、オープンフローモードで必要なカルシウム濃度でランニングバッファーとシステムを40分間平衡化します。カルシウムを含むランニングバッファーにタンパク質を加えます。平衡定常状態に達するまで、ループフローモードでタンパク質の適用を実行します。