タンパク質-ホスホイノシチド相互作用を検出するための担持脂質二重膜のpH調節アッセイ

ホスファチジルイノシトール 4,5-二リン酸 (PIP2) は、微量の膜結合リン酸化リン脂質です。特定のPIP2結合ドメインを持つホスホリパーゼC(PLC)は、PIP2に結合し、いくつかの細胞プロセスに不可欠な二次メッセンジャーを生成します。

PLC-PIP2相互作用をin vitroで検出するには、PIP2とリン脂質混合物を含む小さな単層小胞、SUV、酸性懸濁液から始め、そのうちの1つはpH感受性蛍光色素に結合します。

溶液を組み立て済みの製造されたマイクロ流体デバイスの入口にピペットで入れ、出口チューブを接続します。デバイスを蛍光顕微鏡ステージに移し、固定します。重力によって、SUVは親水性ガラスカバーガラスで作られたマイクロチャネルの床を通過します。

SUVはガラス表面に吸着し、溶液のpHにより2つの間の静電反発力が減少します。SUV は表面と相互作用し、変形および融合して大きな小胞を形成します。

臨界表面被覆後、小胞は自発的に破裂し、支持された脂質二重層 SLB を形成します。バッファーをチャネルに通し、吸着されていない小胞を除去します。

適切な蛍光チャネルを使用して、マイクロチャネルを画像化し、SLB中のpH感受性色素蛍光(低pHで高蛍光)を視覚化および測定します。

換えPLCソリューションをマイクロチャネルに導入します。溶液の中性pHは、PLCの等電点を下回ると、PLCは正に帯電します。

PIP2結合ドメインを持つ組換えPLCは、PIP2に結合し、負に帯電した水酸化物イオンを二重層表面に動員します。これにより、二重層表面がより塩基性になり、色素のプロトン化状態がシフトし、蛍光消光が発生し、PLC-PIP2相互作用が示されます。

100マイクロリットルのホスファチジルイノシトール-4 5-二リン酸に小さな単層小胞を含む0.65ミリリットルの微量遠心チューブに移します。6.4マイクロリットルの0.2通常の塩酸を加えて、溶液のpHを約3.2に調整します。

pHを調整した10マイクロリットルの小さな単層小胞溶液を入口から各チャネルにピペットで入れ、溶液が出口に到達するまでピペットを通して圧力を加えます。チップをピペットから取り外し、デバイスに取り付けたままにします。各チャネルに対してこのステップを繰り返した後、デバイスを室温で10分間インキュベートします。

マイクロチャネルへの小胞の注入は、デバイスの組み立て直後に実行する必要があります。その間、入口チューブと出口チューブのセットをカットします。ピンセットを使用して、アウトレットチューブセットをデバイスに接続し、デバイスを顕微鏡ステージにテープで

インレットチューブセットの一端を円錐形のチューブに含まれる25ミリリットルのランニングバッファーに浸し、テープで留めてチューブが固定されていることを確認します。ラボジャッキを使用して、コニカルチューブをデバイスよりも高い地面に置き、重力流を介して溶液をマイクロチャネルに押し込みます。

インレットチューブについて、シリンジを使用して、チューブの自由端から1ミリリットルのランニングバッファーを引き出します。ピペットチップをインレットから取り外し、インレットチューブの自由端をデバイスに挿入します。このプロセスを繰り返して、すべてのインレット チューブ ピースをデバイスに接続します。チャネルにランニングバッファーを流すことで、過剰な未破裂の小胞を除去し、二重層を実験条件に平衡化するのに役立ちます。

次に、顕微鏡制御ソフトウェアを開きます。左側のパネルで、「顕微鏡」タブをクリックし、「10倍」対物レンズを選択します。「ライブ」をクリックし、ツールバーの「Alexa 568」画像アイコンをクリックします。細調整ノブと粗調整ノブを使用して、マイクロチャネルに焦点を合わせます。デバイスをスキャンして、SLB とチャネルの品質を確認します。

次に、ツールバーの「FLシャッタークローズ」画像アイコンをクリックします。「取得」タブをクリックし、「基本調整」で露光時間を選択します。露光時間を200ミリ秒に設定します。左側のパネルで、「多次元取得」をクリックします。「フィルター」メニューで、赤いチャンネルを選択します。次に、「タイムラプス」メニューをクリックします。時間間隔を5分、期間を30分に設定し、経過メニューを設定します。

「測定」タブの「円」ツールを選択し、任意のチャンネルに円を描きます。円が選択されているときに右クリックし、「プロパティ」を選択します。「プロファイル」タブで「すべてのT」にチェックを入れると、蛍光強度が時間の関数として表示されます。次のステップに進む前に、この曲線が平衡を示すプラトーに達していることを確認してください。

緩衝液を装置と同じ接地まで下げて流れを止めます。一度に1つずつ、各出口チューブを取り外し、ピペットを使用して各タンパク質希釈液200マイクロリットルを出口チャネルに適用します。圧力をかけないでください。重力に任せてください。チップをピペットから取り外し、マイクロ流体デバイスに取り付けたままにします。チャネルごとにこのプロセスを繰り返し、このプロセス中にチャネルに気泡が導入されないようにします。

次に、インレットチューブをマイクロ流体デバイスの下の地面まで下げて、マイクロチャネルを通るタンパク質の流れを開始します。チューブの自由端を廃棄物容器にテープで留めます。プレクストリン相同性ドメインの希釈液を30分間流します。ソフトウェアの左側のパネルの「タイムラプス」タブで、「開始」をクリックしてイメージングを再開します。