タンパク質-ホスホイノシチド相互作用を検出するための担持脂質二重膜のpH調節アッセイ

ホスファチジルイノシトール 4,5-二リン酸 (PIP2) は、微量の膜結合リン酸化リン脂質です。特定のPIP2結合ドメインを持つホスホリパーゼC(PLC)は、PIP2に結合し、いくつかの細胞プロセスに不可欠な二次メッセンジャーを生成します。

PLC-PIP2相互作用をin vitroで検出するには、PIP2とリン脂質混合物を含む小さな単層小胞、SUV、酸性懸濁液から始め、そのうちの1つはpH感受性蛍光色素に結合します。

溶液を組み立て済みの製造されたマイクロ流体デバイスの入口にピペットで入れ、出口チューブを接続します。デバイスを蛍光顕微鏡ステージに移し、固定します。重力によって、SUVは親水性ガラスカバーガラスで作られたマイクロチャネルの床を通過します。

SUVはガラス表面に吸着し、溶液のpHにより2つの間の静電反発力が減少します。SUV は表面と相互作用し、変形および融合して大きな小胞を形成します。

臨界表面被覆後、小胞は自発的に破裂し、支持された脂質二重層 SLB を形成します。バッファーをチャネルに通し、吸着されていない小胞を除去します。

適切な蛍光チャネルを使用して、マイクロチャネルを画像化し、SLB中のpH感受性色素蛍光(低pHで高蛍光)を視覚化および測定します。

組

換えPLCソリューションをマイクロチャネルに導入します。溶液の中性pHは、PLCの等電点を下回ると、PLCは正に帯電します。

PIP2結合ドメインを持つ組換えPLCは、PIP2に結合し、負に帯電した水酸化物イオンを二重層表面に動員します。これにより、二重層表面がより塩基性になり、色素のプロトン化状態がシフトし、蛍光消光が発生し、PLC-PIP2相互作用が示されます。

100マイクロリットルのホスファチジルイノシトール-4 5-二リン酸に小さな単層小胞を含む0.65ミリリットルの微量遠心チューブに移します。6.4マイクロリットルの0.2通常の塩酸を加えて、溶液のpHを約3.2に調整します。

pHを調整した10マイクロリットルの小さな単層小胞溶液を入口から各チャネルにピペットで入れ、溶液が出口に到達するまでピペットを通して圧力を加えます。チップをピペットから取り外し、デバイスに取り付けたままにします。各チャネルに対してこのステップを繰り返した後、デバイスを室温で10分間インキュベートします。

マイクロチャネルへの小胞の注入は、デバイスの組み立て直後に実行する必要があります。その間、入口チューブと出口チューブのセットをカットします。ピンセットを使用して、アウトレットチューブセットをデバイスに接続し、デバイスを顕微鏡ステージにテープで

貼り付けます。

インレットチューブセットの一端を円錐形のチューブに含まれる25ミリリットルのランニングバッファーに浸し、テープで留めてチューブが固定されているこ